酶学分析ALT分析Km值.pptVIP

第四章 酶学分析 第一节 酶的分离纯化 一、酶的分离 二、酶的纯化 第二节 酶的活力测定 一、酶活力与酶反应速度 1．酶活力 酶活力(Enzyme Activity)是指酶催化化学反应的能力，也即酶催化某一化学反应的反应速度。检查酶的含量及存在，不能直接用重量或体积来表示，通常用它催化某一特定反应的速度来表示，即用酶的活力来表示。由于酶活力受温度、pH等环境因素的影响很大，在进行酶活力测定时，必须使这些因素保持恒定。 2．酶反应速度 酶活力测定常采用测反应初速度的方法。底物浓度的变化在起始浓度的5％以内的速度为初速度。底物浓度太低时，5％以下的底物浓度变化不易测准，所以在测酶活力时，往往使底物浓度足够大，这样酶促反应对于底物来说是零级反应，而对于酶来说却是一级反应，由此测得的速度就能较可靠地反映酶的活力。 二、测定方法 三、酶的活力单位(U)及比活力 第三节 酶促反应动力学 酶促反应动力学研究的是酶促反应速度及其影响因素。这些因素包括底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂、抑制剂等。酶促反应动力学的研究具有重要的理论和实践意义。 一、底物浓度对反应速度的影响 在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度影响的关系曲线呈矩形双曲线。在底物浓度较低时，反应速度随底物浓度的增加而急剧上升，两者成正比关系；随着底物浓度的进一步增高，应速度的增幅度不断下降；如果继续加大底物浓度，反应速度将不再增加，此时酶的活性中心已被底物饱和。 二、酶浓度对反应速度的影响 在酶促反应系统中，当底物浓度大大超过酶的浓度，使酶被底物饱和时，反应速度与酶的浓度成正比例关系。 三、温度对反应速度的影响 酶是生物催化剂，温度对酶促反应速度具有双重影响。温度升高时，一方面可加快酶促反应速度，同时也增加酶的变性。综合这两种因素，酶促反应速度最快时的环境温度称为酶促反应的最适温度。温血动物中酶的最适温度多在35～40℃之间。温度高于最适温度时，反应速度则因酶变性而降低。 酶的最适温度不是酶的特征性常数，它与反应进行的时间有关。酶可以在短时间内耐受较高的温度。相反，延长反应时间，最适温度便降低。 四、pH对反应速度的影响 酶分子中的许多极性基团在不同的pH条件下解离状态不同，所带电荷的种类和数量也各不相同，酶活性中心的某些必需基团往往仅在某一解离状态时才具有最大的催化作用。此时的环境pH称为酶促反应的最适pH。动物体内多数酶的最适pH接近中性。 最适pH也不是酶的特性常数，它受底物浓度、缓冲液的种类与浓度，以及酶的纯度等因素的影响。溶液pH高于或低于最适pH时，酶的活性降低，远离最适pH时甚至会导致酶的变性失活。因此在测定酶的活性时，应选用pH适宜的缓冲液以保持酶活性的相对恒定。 五、激活剂对反应速度的影响 使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质称为酶的激活剂(activator)，可分为必需激活剂和非必需激活剂。必需激活剂大多为金属离子，如Mg2+、K+、Mn2+等，它们对酶促反应是不可缺少的，否则将测不到酶的活性。非必需激活剂是指激活剂不存在时，酶仍有一定的催化活性，但它的存在能提高酶的催化活性。 六、抑制剂对反应速度的影响 凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质统称为酶的抑制剂。根据抑制剂与酶结合的紧密程度不同，对酶的抑制作用分为可逆性抑制与不可逆性抑制两类。 第四节 酶法分析 一、单酶反应定量法 二、偶联酶反应定量法 第五节 同工酶 第五节 酶在医学上的应用 血清谷-丙转氨酶(ALT)活性的测定 (改良Mohun法) 【原理】 转氨酶在人体内氨基酸的代谢中占有重要地位。转氨酶有多种，即大多数氨酸均有其特异的转氨酶，其中对谷-丙转氨酶(ALT)和谷革转氨酶(AST)的研究最多。ALT和AST广泛分布于人体各组织器官的细胞内，且活性很高，但正常人血清中这两种转氨酶活性却很低，说明在正常情况下只有极少量从组织释放至血浆中。当组织受损伤，造成细胞通透性增加乃至细胞坏死时，ALT括性和AST活性可明显升高。园此ALT和AST活性测定已广泛应用于临床检验。 ALT活性测定的方法很多，主要有两类：一是卡门氏(Karman)分光光度法，二是比色测定法。 Karman分光光度法的原理如下： 比色测定法目前国内采用三种方法，即金氏法(King法)、穆氏法(Mohun法)和赖氏法(Reitman一Frankel法)。其原理完全相同，现简述如下。 【试剂】 (1)0.1mol／L磷酸二氢钾溶液：称取KH2PO4(A.R)13.614g，用重蒸馏水溶解后转