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乙肝两对半的检测 河北大学基础医学实验教学中心 一、HBsAg的测定：为双抗体夹心法 采用多克隆抗-HBS包被反应板，加入待测标本，同时加入单克隆抗-HBs-HRP，如待测标本中含有HBsAg时就与包被抗-HBs、抗-HBs-HRP结合形成复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之就无显色反应。 二、HBsAb的检测：为双抗原夹心法 采用HBsAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBsAg-HRP，如待测标本中含有HBsAb时就与包被HBsAg-抗-HBs- HBsAg -HRP结合形成复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之就无显色反应。 三、 HBeAg的检测：为双抗体夹心法 采用多克隆抗-HBe包被反应板，加入待测标本，同时加入单克隆抗-HBe-HRP，如待测标本中含有HBeAg时就与包被抗-HBe、抗-HBs-HRP结合形成复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之就无显色反应。 四、 HBeAb的检测：为竞争法 采用基因工程重组HBeAg包被反应板，加入待测标本，同时加入抗-HBe-HRP，与抗原形成竞争结合，如待测标本中抗-HBe含量高，则抗-HBe-HRP与HBeAg结合少，加入TMB底物时显色淡，反之则显色深。 五：HBcAb的检测 为竞争法 采用基因工程重组HBcAg包被反应板，加入待测标本，同时加入抗-HBc-HRP，与抗原形成竞争结合，如待测标本中抗-HBc含量高，则抗-HBc-HRP与HBcAg结合少，加入TMB底物时显色淡，反之则显色深。 【实验材料】 1 ．乙肝病毒两对半酶联免疫诊断试剂盒（由厂商供应）。 2．微量加样器，混合振荡器，酶标测定仪，恒温箱，吸水纸，蒸馏水等。 【实验步骤】 按试剂盒说明操作： 1、将阳性对照、阴性对照和待测标本进行编号； 2、分别加入阳性对照、阴性对照和待测血清50ul; 3、每孔加入相应的酶标记物一滴，混匀后，用胶条封板，置 37℃ 孵育30 min； 4、洗涤： 甩去孔内液体，扣干，用洗涤液注满各孔，静置2 s，甩干，重复5次后拍干。 5、显色 每孔加显色剂A、B各50 μl（1滴）振荡混匀，37℃避光放置10 min。 6、加终止液终止。 【实验结果】 1．目测 在白色背景下观察各孔显色情况，前三项 有明显黄色者为阳性，无色者为阴性，而后亮相则有明显黄色者为阴性，无色者为阳性。 2．酶标仪检测 每孔加终止液50 μl（1滴）混匀，用酶标仪450 nm波长测各孔A值。 【注意事项】 1．试剂盒应于4℃存放，在有效期内使用。 2．微孔条须密封防潮，从冷藏环境中取出时,应在室温中平衡至潮气尽干后方可开封启用，余者及时封存。 　　 3．滴加试剂前应将瓶摇匀，使液体混匀。滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确，注意勿将试剂滴在孔壁上。 4．洗涤时各孔均须加满，防止孔口内有游离酶未能洗净。 5．待测标本不可用NaN3防腐。所有样品都应按传染源处理。 * * 【实验目的】 掌握ELISA法检测乙肝两对半的原理、方法、意义。 【实验原理】 将可溶性抗原（或抗体）吸附于固相载体上，加入酶标抗体（或抗原）与吸附在载体上的抗原（或抗体）结合，形成酶标记复合物，再加入酶底物时，即可显色。颜色反应的深浅与相应的抗体或抗原量相关。常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），相应的底物分别是邻苯二胺（OPD）和对硝基苯磷酸盐。实验方法有间接法、夹心法和竞争法 。 测抗原用:夹心法 包被：抗体 加入待测抗原 加入酶标抗体 加入酶的底物 洗涤 测抗体常用：间接法 包被：抗原 加入待测抗体 加入酶标二抗 洗涤 加入酶的底物 竞争法 包被：抗体 有待测抗原，加入底物，显色 包被：抗体 待测抗原和酶标抗原 待测抗原和酶标抗原 没有待测抗原，加入底物，显色