小鼠胚胎干细胞培养及神经分化的研究-动物遗传育种与繁殖专业论文.docx

摘要摘要1，剪刀切割结合针头挤压小鼠胎儿组织能有效获得均匀、大小适中并容易贴壁生 长的小组织块。将这些组织块培养48h，大量的梭形细胞从贴壁小组织块的边 缘游离出的，细胞密度大，细胞生长旺盛，很快形成原代小鼠胎儿成纤维细胞 (MEF)单层。MEF用51ag／ml的丝裂霉素处理2．5—4h，1099／ml的丝裂霉素 处理1．4h或2099／ml的丝裂霉素处理1．2．5h均可有效抑制其分裂，并保持细 胞的正常活力；用14、21、28GRAY的Y射线处理，亦可有效抑制MEF的分 裂，保持细胞的正常活力。2．小鼠ES细胞解冻后，在饲养层培养体系用含LIF(1000U／m1)的完全培养液 培养48h时，ES细胞形成边界清晰光滑的克隆，克隆内细胞排列紧密，难以 辩认单个细胞，克隆边缘未见分化细胞；此时Oct．4细胞表达强烈的Oct-4．GFP 绿色荧光，RT-PCR检测到细胞有高水平的Oct一4 mRNA，碱性磷酸酶AKP反 应结果呈强阳性，表明细胞处于良好的未分化形态。如果在无饲养层培养体系 培养48h，ES细胞出现了不同分化程度的克隆形态，表明饲养层能较好地控 制ES细胞复苏时分化的发生。3．将在饲养层培养体系中已培养2—3代的ES细胞接种于有饲养层及预铺了0．1％明胶(无饲养层)的96孔板中培养，在培养液中添加1000，1500，2000IU／ml 的LIF能显著提高ES细胞的阳性度(有饲养层培养：17．80+3．26，19．58±3．19， 21．8±3．17 V8 2．69±0．26：无饲养层培养：14．14±2．35。17．87±2，38，19．21±2．92 vs 0．016±0．0005，Po．01)及克隆形成率(有饲养层培养：29．1％，31．8％，33．5％vs 6．5％；无饲养层培养：24．7％，27．8％，31．2％vs 0．8％，P(0．01)；但 不同浓度LIF之间的阳性度及克隆形成率差异不显著0O．05)。当不添加LIF 时，饲养层培养法能显著地地提高ES细胞的AKP阳性度及克隆形成率(2．69±0．26 vs O．016±0．0005：6．5％vs 0．8％，p0．01)。说明饲养层细胞在Es细胞 的分化抑制中有一定作用，而起主导作用的是外源LIF。4．培养液种类及添加谷氨酰胺、丙酮酸钠和非必需氨基酸对Es细胞体外培养的 效果影响较小，而培养用水和血清品质对ES细胞体外培养的效果影响较大。 Milli—Q水经亚沸处理能显著提高Es细胞保持未分化状态的能力，优质胎牛血 清能提高Es的AKP阳性度和克隆形成率。5．ES细胞用单层分化法在无血清的DMEM摩12+N2827培养基中进行神经分化时，0-56h克隆逐渐变大，变扁平，边缘逐渐不整齐；96h后，在克隆的边缘VIII摘要出现了向外迁移的、有1．2个突起的圆形或椭圆形细胞，在191h时，细胞可 迁移至克隆边缘的200#m之外，这些有细长突起的细胞表达神经元特异性蛋 白Tau。以后，迁移细胞的突起开始交叠成网状。316h时，细长的纤维可跨越 在不同的克隆之间，长达上千微米。细胞免疫染色检测结果显示，神经分化产 生了三种分化的主要细胞：Nestin阳性的神经干细胞、GFAP阳性的神经胶质 细胞、B—tubulin III阳性的神经元。对阶段性基因表达的变化观察发现，ES 细胞的特异性转录因子Oct．4开始减弱时，神经干细胞特异性基因Soxl表达 丌始，表明细胞由全能状态进入早期神经分化状态，神经元特异性蛋白Tau 的表达在Soxl表达之后。在4_／4+程序神经分化的D13，成团的46C细胞中， 仍可观察到Soxl．GFP绿色荧光的表达，此时的细胞免疫化学染色检测到 Nestin阳性、GFAP阳性的细胞及B．tubulin IIIIEt性细胞，以13一tubulin III阳性 细胞最为多见，它们呈现出多种形态。结果表明，4-／4+程序及单层分化法都 为ES细胞的神经分化提供了从神经分化起始到神经细胞发生所需的环境，但 两种方法获的B．tubulin-III[jN性神经元在形态上有较大的区别，提示它们是处 于不同发育阶段的神经元。6．在含LIF的ES细胞完全培养液中连续培养至48h的ES细胞，其自发分化处 于低水平状态，培养至122h时，这一比例随着培养的天数的增加而略有增加。 用含LIF的ES细胞完全培养液预培养24h的ES细胞，在后续的神经分化中， 早期神经干细胞特异性基因Soxl、神经元特异性基因Tau的表达时序与胚胎 发育过程相符，分化产生了神经干细胞、神经胶质细胞和神经元，细长的神经 纤维交织成广泛而复杂的网状图像；用含LIF的ES细胞完全培养液预培养72h 的ES细胞，在后续的分化实验中，出现了二种结果：①部分细胞去分化成为 大细胞：②部分细胞进入