小鼠听觉上皮发育及其相关分子机制-耳鼻咽喉科学专业论文.docxVIP

小鼠听觉上皮发育及其相关分子机制中文摘要上皮和间充质组织之间的信号交流和相互作用对器官的发生和发育起重要作用。BMP4是TGFB超家族成员中的一个亚型，BMP4及其拮抗因子Noggin调控听觉上皮和内耳周围间充质的发生及发育。然而，BMP4在内耳感觉上皮发育中的作用目前存在较大的争议。我们首先采用胚胎期小鼠第11．5天(E11．5)～13．5天(E13．5)的听觉上皮体外培养，建立胚胎期小鼠听觉上皮的体外培养模型。所有组织的培养时间均等同于体内发育至E18．5的时间(即E11．5+7d invitro(nlV)，E12．5+6DIV，E13．5+5DIV)，观察听觉上皮形态和毛细胞分化情况。结果表明听觉上皮可以在体外无血清培养环境下存活并生长，其中E12．5～E13．5的听觉上皮培养后发育形态及毛细胞分化接近正常发育形态，是研究毛细胞发育机制的合适模型。采用小鼠听觉上皮体外无血清培养模型，以thermolysin获得纯听觉上皮作为实验组，带有相邻间充质的听觉上皮为对照组，研究相邻间充质对听觉上皮发育的影响。结果显示：各胚胎期小鼠听觉上皮培养后毛细胞的数量，对照组均高于实验组。E11．5+7DIV对照组为114．43±17．92，实验组为66．78±20．64，两组统计学差异有显著性(P0．01)；E12．5+6DIV对照组为519．75±98．11，实验组为299．71±23．91，两组统计学差异有显著性(P0．01)；E13．5+5DIV对照组为1214．38±231．88，实验组为1158．67±176．09，两组统计学无差异。其中，在E12．5和E13．5实验组内毛细胞发育不良，而E12．5对照组内毛细胞呈1～3排不规则排列，E13．5对照组的内毛细胞和外毛细胞出现明显的界限，内毛细胞呈纵向单排生长。另外，对照组的毛细胞／支持细胞比例也均高于实验组。以上结果表明小鼠听觉上皮相邻的间充质组织对耳蜗感觉上早期形态发育及毛细胞分化有促进作用。我们采用El1．5，一--E13．5d,鼠听觉上皮体外无血清培养模型，通过加入外源性BMP4蛋白或其抑制剂Noggin，研究BMP4在听觉上皮发育中的作用。加入外源性 BMP4后，实验组的毛细胞数量均高于对照组，并呈剂量依赖性。E11．5+7DIV对照组毛细胞数量(114．43±17．915)和bmplOng组(150．80±29．107)有统计学差异(P0．05)，和bmp20ng组(198．33±40．741)有统计学显著差异(P0．01)，E12．5+6DIV对照组毛细胞数量(519．75±98．112)和bmp20ng组(650．29±173．241)有统计学差异(P0．05)，但与bmplOng组(588．50±111．524)却无统计学差异。E13．5培养后实验组虽然和对照组相比均无统计学差异，但在统计数量上均有增多。另外，各实验组的毛细胞／支持细胞比例也均高于对照组，但它们的作用与开始培养的发育时期和剂量相关，E11．5+7DIV实验组(bmplOng组：0．36704-0．0616；bmp20ng组：0．4386-0．1185)虽然在统计数值上有增高，但和对照组(O．3267±0．0755)却无统计学差异。E12．5+6DIV对照组(0．6657±0．0214)和bmp lOng组(0．7038±0．0407)有统计学差异(P0．05)，而和bmp20ng组(0．7641±0．04521)有统计学显著差异(P0．01)，而E13．5+5DIV对照组(0．6820±0．0187)和bmp20ng组(0．7944±0．0806)有统计学差异(P0．05)，但和bmplOng组(0．70644-0．0967)却无统计学差异。通过在培养中加入Brdu标记增殖细胞，发现BMP4组通过增殖而来的毛细胞数量和对照组相比较并无差别。Shh和Sox2是听觉器官发育，特别是前感觉区(prosensorydomain)形成的关键基因。我们发现加入外源性BMP4后，Sox2、Shh基因的表达明显下调，E12．5+6DIVbmp420ng组的Sox2mRNA的量为对照组的81．2％，而ShhmRNA的量仅为对照组的43．7％。当加入BMP4抑制剂0．3斗g／mlNoggin后，导致毛细胞显著减少(E11．5+7DIV：40．604-14．188：E12．5+6DIV：65．14±22．974；E13．5+5DIV：231．17±90．061)均远少于对照组，统计学差异有显著性(P0．01)。这些结果表明：听觉上皮发育早期，Bmp4能促进感觉前体细胞分化为毛细胞，其作用可能与抑SUSox2、Shh基因表达有关。另外，采用免疫荧光共标技术，观察Pax2、Sox2及Proxl在小鼠内耳发育中的时空表