中学联盟辽宁省北票市高级中学高中生物选修1 5.2多聚酶链式反应扩增DNA片段 课件 (共29张PPT).ppt

* 多聚酶链式反应(PCR技术)， 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为DNA体外扩增技术。 1、DNA分子的组成成分和结构 DNA 分子的基本组成单位是 .共有 种,每个基本单位是由一分子的 、一分子的 、和一分子的 构成。 脱氧核甘酸 4 磷酸 碱基 脱氧核糖 二 、基础知识 脱氧 核糖 含氮碱基 磷酸 A G C T 1、DNA的基本单位－脱氧核苷酸 1 2 3 4 5 O 那么DNA分子的平面结构怎样呢？ 2、DNA分子的平面结构 A T G C A G C T 氢键 5端 3端 5端 3端 规定： DNA分子的3′ 端与5′ 端 -OH端为3′ ; 磷酸基团的末端为5′。 2、DNA分子复制的条件 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 打开DNA双链 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成子链的原料 DNA聚合酶 催化合成DNA子链 引物 使DNA聚合酶能够从引物的 3′ 端开始连接脱氧核苷酸 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物（ RNA） 打开DNA双链 模板 合成子链原料 催化子链合成 使DNA聚合酶能从引物3′端开始连接脱氧核苷酸 体外扩增DNA 如何提供相似环境？ 变性（ 80-100℃ ） Taq聚合酶（耐高温） 20—30个核苷酸构成DNA或RNA PCR的反应过程 1、PCR的反应步骤 变性、复性和延伸 靶序列 靶序列 PCR 循环第一步 ：加热变性 靶序列 靶序列 引物 Ⅰ 引物 Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ PCR 循环第二步 ：引物与靶序列退火 靶序列 靶序列 引物Ⅰ 引物Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ Taq DNA 聚合酶 PCR 循环第三步 ：引物延伸 靶序列 靶序列 第1个 PCR 循环完成后 ：得到两个拷贝的靶序列 三、PCR的总结 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 高温变性 低温复性 重复1~3步30轮 3、DNA复制的方向 DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸 2、步骤：变性 ——复性——延伸 原理： 利用DNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合，从而完成体外DAN分子的扩增。 循环次数 DNA数量 1 2 2 4 3 8 20 1,048,576 30 1,073,741,824 3、30次循环后靶序列扩增的数量 4、PCR 循环的结果 ② DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增 ①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸 三、 PCR反应的实验操作 1、PCR仪 设备及用具 实质上一台能够自动调控温度的仪器 微量移液器 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次 1、准备 2、移液 （二）实验操作步骤 按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上 用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂 ①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁 ②注意： 3、混合 B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀 A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢 将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序 ①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s 4、离心 5、反应 ②离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果 PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到： 6、注意事项 ①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌； ②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头 （一）理论上DNA扩增数目的计算 四、课题成果评价 1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n 2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n （二）实验中DNA含量的测定 1 、原理 可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关 2 、过程 ①稀释 2μL PCR反应液，加入98μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释 ②对照调零 以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零 取DNA稀释液100μL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值 ③测定并计算 DNA含量