葡聚糖凝胶Sephadex G–25柱层析法脱盐分离蛋白质实验技术总结精选.pptVIP

* 在凝胶层析中，不仅要保持静水压的恒定，还要保持适当的静水压。这是因为G–75以上的软胶胶体柔软易变形， 最初流速会很快，其后随着静水压力过大将使软胶变形压紧，流速逐渐降低，最后甚至流不出。 保持恒定正确的静水压是凝胶层析时获得满意结果的必要条件。 脱盐一般使用的是G–25属于硬胶，硬胶不易变形，受静水压的影响较小。 * 6. 检测   在收集的同时，用 20%磺酰水扬酸检测；加入奈氏试剂检测蛋白质中的硫酸铵，蛋白管中不出现棕色。 合并纯化后的蛋白质管以待用。以光密度值为纵坐标（紫外检测，因时间长） ，以收集管的顺序号为横坐标，在坐标纸上绘图。可获具有一条洗脱峰的曲线，称为洗脱曲线，用以表示被分离物质流出的状态。 * * 7. 凝胶的洗涤及保存  由于凝胶对被分离的物质基本无吸附作用，所以无需“再生”，只要用洗脱液冲洗后即可连续使用。但因多次使用凝胶颗粒将逐渐沉积压紧，流速将减慢，所以使用一段时间后应倒出来，清洗后重新装柱。 * 凝胶暂时不用存放在4℃冰箱中； 若放在室温保存应加入0.02%叠氮钠（NaN3）或0.01%乙酸汞等防腐剂；以防发霉。凝胶长期不用，可用 乙醇 、再用乙醚除乙醇，抽干即可， 在表面皿上30℃逐步烘干。 我们所购置的该试剂100g,本科生可使用３～４年。 * 葡聚糖凝胶Sephadex G – 25柱层析法脱盐分离蛋白质  实验技术总结 引 言 层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家Michael等发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography) 。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。1944年出现纸层析， 以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。 * 层析法的基本原理 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）体系中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。 * 如盐析（粗分级分离）向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4)2SO4，Na2SO4，Na2SO4]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。 * 凡盐析所获得的粗制蛋白质（如盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。脱盐常用透析法和凝胶过滤法。 * 大分子保持天然构象状态（功能有关），有高度的生物活性。 常用的柱层析方法有葡聚糖凝胶柱层析（分子筛层析）、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等。 *  一、实验目的 （1）掌握葡聚糖凝胶柱层析法脱盐分离蛋白质的原理 （2）学会葡聚糖凝胶柱层析法脱盐和分离蛋白质实验操作技术 凝胶过滤层析技术 * 二、基本原理 当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。 *  凝胶层析（gel chromatography）又称为凝胶过滤（gel filtration）、分子筛过滤（molecular sieve filtration） 等。它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。 * 凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。 小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶 * 柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。这样被分离物质即被按分子的大小分开。 * *