- 1、本文档共85页,可阅读全部内容。
- 2、有哪些信誉好的足球投注网站(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
第13章 核酸的结构与性质精选
● 1个核苷酸对(A.U),浓度为Co=1.0mmol/L。 则50%复性时,Cot1/2=4×10-6mol.s/L,t=0.004秒 复性100%,Cot=10-4 mol.s/L , t=0.1秒 ●E.coli 4.2×106碱基对,浓度Co=1.0 umol/L。 复性50%时, Cot1/2=10 mol.s/L,t=107秒,约115天 复性100%时,Cot=500 mol.s/L ,t=5×108秒,5758天 复性动力学曲线 复性速度可用Co·t衡量。Co为变性DNA原始浓度(mol·L-1),t为时间(秒)。根据复性动力学曲线可以测定基因组的大小和重复序列的拷贝数。 (三) 分子杂交 分子杂交的原理示意图 在DNA变性后的复性过程中,如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中,只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系,在适宜的条件(温度及离子强度)下,就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。 这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成,也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。 一)核酸的超速离心 原理:由于不同构象的核酸(线形、环形、超螺旋)的密度,所以在溶液中的浮力密度也不同,即沉降速率不同,当把核酸溶液进行超速离心时,不同大小的核酸因福利密度的差异而被分开。常用的溶液有CsCl,蔗糖、甘油等。 五、核酸的分离与纯化 浮力密度: RNA>DNA 变性DNA>双链DNA >蛋白质 变性程度越大,浮力密度越大 1、DNA分子的大小 : 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比; 2、琼脂糖浓度 : 浓度越低,相同核酸分子迁移越快; 3、DNA的构象: 超螺旋环状>线状>切口环状。 4、凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭: 溴化乙锭(EB)插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。 5、所用的电压: 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。 二)核酸的凝胶电泳 (一)琼脂糖电泳(agarose gel electrophoresis) 用于大片段DNA的分离,精度低,但分离范围广。 DNA的迁移速率决定因素 不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围 浓 度(%) 标 准 (kb) 高强度(kb) 低熔点(kb) 低黏度低溶点(kb) 0.3 1~50 0.5 0.7~25 0.8 0.5~15 0.8~10 0.8~10 1.0 0.25~12 0.4~8 0.4~8 1.2 0.15~6 0.3~7 0.3~7 1.5 0.08~4 0.2~4 0.2~4 2.0 0.1~3 0.1~3 3.0 0.05~1 0.5~1 4.0 0.1~0.5 6.0 0.01~0.1 (二)聚丙烯酰胺凝胶电泳 (polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE ) 用于分析RNA或Mr小于1000bp的DNA片段,精度非常高。 DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围 丙烯酰胺浓度(%) 有效分离范围(bp) 二甲苯氰FF 溴酚蓝 3.5 1000~2000 460 100 5.0 80~500 260 65 8.0 60~400 160 45 12.0 40~200 70 20 15.0 25~150 60 15 20.0 6~100 45 12 (三)脉冲场凝胶电泳 pulsed-field gel electrophoresis, PFGE) 为何选PFGE? 超过一定大小(40kb)的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速率几乎与分子大小无关,而主要决定于电场强度,故以相同速率迁移。PEGE 解决了这一问题。 PFGE 工作的基本原理 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。该法可分离长至5Mb的DNA分子。严格说来,应叫交替电场凝胶电泳。 B+ A- +A -B 脉冲电场电泳示意图 A- +A B- +B 垂直交变电场系统 场翻转系统 箝位匀强电场系统 旋转胶系统 A- +A B- +B A- +A B- +B - + 六、核酸序列的测定 (一)双脱氧终止法(酶法) Sanger,英国,1955确定牛胰岛素结构, 1958获诺贝尔化学奖;1975设计出DNA测序法,1980 获诺贝尔化学奖。 Sanger 双脱氧链终止法 DNA全自动测序 变性 (二)化学裂解法 Maxam-Gilbert,1977 原理:利用特异性的化学裂解法,制备出长度只差一个核苷酸的片段群,然后将此片段群经测序胶电泳和放射自显影得到测序图谱。 第一步,对特定碱基(或特定类型的碱基)进行
文档评论(0)