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实 验 内 容 1.病例四总结 2.新隐墨汁负染 3.真菌培养法、真菌菌落、菌丝（示教） 4.真菌皮屑试验（操作，每组一份） 5.支原体、衣原体包涵体，恙虫病立克次体观察 6.病例五、六、七的讨论 病例四 患者，女性，43岁，体重45kg。于2012年11月19日受凉后出现头痛，为持续性头部胀痛，伴有视力下降，视物模糊而入院。 病史：患者曾自行口服感冒清热颗粒3d症状无好转，遂就诊于某市级医院以颅内感染进行抗病毒治疗，亦未见好转。 入院查体：体温37℃，脉搏88次/min，呼吸20次/min，血压126/90mmHg；神清语利，双侧瞳孔等大等圆，对光反射消失，颈项强直，布氏征（＋），余内科检查无特殊发现。头颅CT以及脑血管造影无特殊改变。眼底检查见视乳头水肿。 实验室检查：脑脊液（CFS）压力250mmHg，脑脊液（CSF）白细胞总数130×106个/Ｌ。 入院进行脑脊液生化检查：糖定量0.3mmol/L，蛋白定量1.65g/L，氯化物定量113.5mmol/L。脑脊液涂片检查：抗酸染色（-），革兰染色未发现革兰阴性成对排列球菌，墨汁染色（＋）。患者入院后出现恶心、呕吐、发热等不适，结合临床复查各项指标后，隐球菌性脑膜炎诊断明确。既往史：既往体健，否认鸟类接触史，否认有结核、伤寒、菌痢、严重急性呼吸综合征（SARS）等传染病史。 附临床检验正常参考值： 脑脊液检查：压力90-180 mmHg，白细胞总数（WBC）0～8×106／L，其中LC：MC为7：3，蛋白含量0.05-0.45g/L，糖含量2.5-4.5mmol/L，氯化物含量120-130mmol/L。 该患者患有什么疾病？ 如何进行微生物学检查？ 诊断思路： 脑膜刺激征、脑脊液压力、白细胞、蛋白、糖 氯化物 脑内化脓菌感染？结核菌？真菌？ 鸽场附近 初诊：新生隐球菌感 染？ 脑脊液抗酸染色阴性、革兰染 色 未发现脑膜炎奈瑟菌、LC：MC 取标本： 脑脊液 脑脊液墨汁染色 新生隐球菌墨汁染色 原理：负染 方法： 1.玻片上滴加已与精致墨汁混匀的病人脑脊液 标本； 2.加盖玻片； 3.低倍镜检。 结果： 1、圆形或卵圆形菌体 2、芽生孢子。 3、荚膜。 新生隐球菌墨汁染色 菌体 荚膜 分离培养鉴定：沙保弱培养基 尿素酶试验：阳性 含有二酚底物的培养基上，由于具有酚氧化 酶，在胞壁中产生黑色素，使菌落呈黑色 抗原检查：胶乳凝集试验，脑膜炎患者阳性 率可达90% 真菌示教 1.真菌培养法： 大培养法、小培养法 2.真菌的菌落： 酵母菌、白色念珠菌、石膏样小孢子菌 3.真菌的孢子和菌丝： 石膏样小孢子菌、青霉菌、白假丝酵母菌 真菌培养法 大培养法 1、用途：形态、色素。 2、方法： （1）沙保弱斜面培养基 （2）接种，石蜡封闭管口棉塞 （3）22～28℃培养。 （4）1周后观察。 小培养法（小瓷片培养法） 1、用途：观察丝状菌不同发育阶段及完整的基 本结构 2、方法： （1）小瓷片的制备 （2）装沙保弱培养基、接种真菌 （3）培养观察：22-28℃ 真菌的菌落 1.酵母型菌落 2.类酵母型菌落 3.丝状菌落 4.二相性菌落 真菌的菌落 1、酵母型菌落： 圆形、较大、白色、表面光滑湿润、无菌丝长入培养基内，类似一般细菌菌落。 2、类酵母型菌落： 圆形、较大、白色、表面中间粗糙、起皱，假菌丝侵入培养基内。 3、丝状菌落： 大都有气生菌丝、呈绒毛状、粉状、棉花样等，色泽多种多样，菌落底部有营养菌丝长入培养基内。 真菌的菌落 真菌的孢子 叶状孢子 分生孢子 孢子囊孢子 新生隐球菌 酵母型菌落：沙保弱培养基，室温/37℃，2-5天，乳白色、不规则酵母型菌落，表面蜡样光泽 镜检：圆形或卵圆形菌体，厚膜孢子，芽生孢子，有时也可见到芽管 石膏样小孢子菌的大分生孢子 体积较大 由多个细胞组成 呈梭状 内有间隙 由生殖菌丝末端 的细胞分裂或收缩形成 青霉菌的小分生孢子 体积较小 一个孢子只有一个细胞 呈扫帚状 菌丝有间隙 由生殖菌丝末端 的细胞分裂或收缩形成 白假丝酵母菌孢子和假菌丝 革兰染色阳性 着色不均匀 由细胞出芽形成菌丝，无隙，称为假菌丝 白假丝酵母菌厚壁孢子和假菌丝 真菌皮屑试验 方法： 1、取皮屑； 2、10％NaOH消化1min； 3、加盖玻片，火焰上微微加热； 4、直接低