盐芥基因组dna的提取.pptVIP

实 验 汇 报 盐芥基因组DNA的提取 组员：文艺、杨传真、王震、郑微 实验原理 1、植物组织DNA的提取： 对于植物的组织和细胞通常可以采用机械研磨的方法破碎，用抗氧化剂或强还原剂（如巯基乙醇）降低植物细胞中含有的多种酶类对DNA抽提产生的不利影响，在植物组织或细胞磨碎后，采用添加十二烷基肌酸纳、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基硫酸钠等离子型表面活性剂，溶解细胞膜和核蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来 。 实验原理 通过加入氯仿-辛醇，使蛋白质变性，并通过离心分层，DNA溶于上层水相，变性后的蛋白则停留在中间层及有机相中。吸出上层水相，重复上述加入氯仿-辛醇、离心、吸出水相的过程，能将蛋白等较为彻底的除去。在吸出的水相中加入异丙醇或乙醇可使DNA沉淀，将沉淀用洗涤缓冲液清洗后干燥，用TE溶解，即可获得该植物组织的DNA。 实验原理 2、琼脂糖凝胶电泳： 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。 实验原理 DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。 试剂 CTAB抽提缓冲液：2g CTAB，8.18g NaCl，0.74g EDTANa2·H2O，加入10ml 1mol/L的Tris-HCl（pH 8.0），0.2ml巯基乙醇，定容至100ml。 洗涤缓冲液76ml无水乙醇，0.077g巯基乙醇，定容至100ml TE 10mmol/L Tris-HCl（pH 7.4），1mmol/L EDTA。 氯仿-辛醇 24:1（V:V） 900μL 试剂 异丙醇 液氯 溴化乙锭溶液 2.5μl 1倍浓度的TAE 50ml 0.25%的溴酚蓝 2μl 琼脂糖 0.4g 实验步骤 （一）组织DNA提取： 先将900μL CTAB 抽提缓冲液加到2 mL 的离心管中，于65℃水浴中预热。 取1.5 g叶片置于研钵中，先剪成小碎片后加液氮尽快磨至粉状。 取约0.1g的粉末加到有预热CTAB的离心管中，小心混匀。 65℃保温40min，其中每隔10min轻轻摇动离心管。 实验步骤 取出离心管，冷却2min后，加入900μL氯仿-辛醇，小心上下颠倒并持续2~3min，是两者混合均匀。 室温条件下6000r/min离心10min 将离心后的上层水相用移液器转移到离心管中；加入总体积2/3的异丙醇，将离心管慢慢上下摇动30s，使异丙醇有水层充分混合。 通过3000r/min离心2min，小心倒掉液体，再加入1ml洗涤缓冲溶液，轻轻悬浮沉淀，室温下放置20min；通过3000r/min离心2min ，小心倒掉液体，加1ml洗涤溶液同样洗涤20min。 实验步骤 通过2500r/min离心10min，弃尽上清，收集DNA，室温干燥 加100μLTE溶解沉淀。 将该DNA提取液稀释15倍后分别测定A260、A280值，并计算有效浓度。 剩余DNA用于琼脂糖凝胶电泳 实验步骤 （二）琼脂糖凝胶电泳 1、制胶 2、上样电泳 3、紫外观察 实验结果 1.紫外分光光度值测定 A260=0.041，A280=0.021 A260／A280=1.951.8 有效浓度为 0.041×50ug/ml=2.05ug/ml 实验结果 分析与讨论 1.所得DNA样品的A260／A280=1.95，大于1.8小于2.0，可知样 品中可能含有RNA，实验中可加入RNase在37℃水浴中保温 30min，除去RNA污染 分析与讨论 2.通过查找资料，Marker中含8个片段，而实验中只有6条带，分析可能的原因： (1)上样量不足，在实验中上样时有Marker溢出 (2) Marker中分子量相近的片段，所产生条带不易辨认 (3) Marker小条带跑出了凝胶 (4)凝胶凝固不均匀 分析与讨论 3.拖尾现象原因 (1)DNA发生了降解 (2)DNA的上样量过多 (3)有蛋白质污染 (4)电泳缓冲液的缓冲能力不强 (5)DNA变性 (6)在实验的操作过程中动作过于剧烈导致DNA断裂为小片段 (7)电泳时电压选择不太合适 分析与讨论 4.实验中样品的点样孔处均有1个明显的亮带，可能是DNA 提取过程中有蛋白污染，可在电泳前用酚除去。 改进CTAB法提取盐生植物DNA 对于盐生植物而言，由于其含有较高水平的酚类，加入PVP40可以与酚类物质结