必威体育精装版教学课程-单克隆抗体.pptVIP

特点： 不需任何特殊设备 克隆出现效率高 实验室常用方法 方法： 细胞悬液通过系列稀释 每个培养孔含0.5～1个细胞 有限稀释法 每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为0.2ml，每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10。 效率最高 价格昂贵 FACS 软琼脂平板法(soft agar method) 37℃、7.5%湿润培养7-14天；克隆生长至2mm时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的24孔板，扩大培养。 吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，或扩大培养、冻存。 配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml) + 细胞冻存液(30%～40% 牛血清，50%～60% RPMI-1640培养液，10%DMSO ) “慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮?保存数年至数十年 “快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复苏 杂交瘤细胞的冻存与复苏 在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故 防止污染 避免染色体丢失 防止非分泌细胞的过度生长 防止细胞密度过高而死亡 细胞冷冻的意义 （1）单克隆性的确定 包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。 A、杂交瘤细胞的染色体分析 对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，正常小鼠脾细胞的染色体数目为40，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62-68，NS-1为54-56； B 、单抗免疫球蛋白的类别和亚类鉴定 免疫扩散 ELISA C、单抗纯度的鉴定 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS、等电点聚焦电泳（IEF）及免疫 转印分析（WB）等方法都可用于鉴定单抗的纯度。PAGE、SDS、IEF、WB （三）单克隆抗体的性质鉴定 （2）单抗理化特性的鉴定 抗体亲合力是指抗体与抗原或半抗原结合的程度，其高低主要是由抗体和抗原分子的大小、抗体分子结合簇（部）和抗原决定簇之间的立体构型的合适程度决定的。亲合力通常以平均内在结合常数（K）表示。 常用的方法有竞争ELISA、非竞争性ELISA 、间接ELISA、间接法夹心ELISA等 （3）单抗与相应抗原的反应性测定 包括各类免疫血清学试验、生物学试验和免疫化学技术等 三、单克隆抗体的制备 经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。 （一）单克隆抗体的产生 1 动物体内诱生方法： 每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只, 使用的动物当然首选BALB/c小鼠 ,将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。可见该法操作简便、经济，不过，腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括Ig） 腹腔注射法 2 体外培养法： a、悬浮培养法：小规模悬浮培养多采用转瓶培养，通过搅拌使细胞呈悬浮状态；而大规模悬浮培养多采用发酵式的生物反应器 b、微载体培养法Microcarrier：主要以交联琼脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作为基质的产品 c、中空纤维细胞培养系统：由中空纤维生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕动泵等组成 d、微囊化细胞培养系统：先将杂交瘤细胞微囊化，然后将此具有半透膜的微囊置于培养液中进行悬浮培养，一定时间后，从培养液中分离出微囊，冲洗后打开囊膜，离心后即可获得高浓度的单抗。 （3）杂交瘤细胞的无血清培养 已报道的各类无血清培养基有含有大豆类脂的、含有酪蛋白的、化学限定性的、无蛋白的、含有血清低分子量成分的无血清培养基 利于单抗的纯化，有助于大规模生产，可减少细胞污染的机会，且成本较低。 但无血清培养细胞的生产率低、细胞密度小，影响了单抗的产量； 可溶性抗原：ELISA抗体捕获法 细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定细胞） （二）单克隆抗体的纯化 前5天进行,预先腹腔注射pristane （1～5）×106细胞 1～3w形成腹水 腹水型单抗的纯化 高滴度腹水 盐析沉淀 亲和层析 离子交换层析 McAb的纯化 ELISA 多头加样枪 ELISA 。 免疫荧光法 （四）单克隆抗体的特性 高度特异性 高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应 对环境敏感性 优点 ： 在体外“永久”地存活