细胞生物学课件--细胞生物学的研究方法.pptVIP

核酸分子杂交技术 具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。 原位杂交： 用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用放射性DNA探针，后来又发明了免疫探针法。 Southern杂交： 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。 Northern杂交： 将RNA转移到薄膜上，用探针杂交。 PCR技术 原理： 是在体外快速扩增特异性DNA片段的技术，它利用DNA半保留复制原理，通过控制温度，使DNA 处于“变性—复性—合成”反复循环中。每一个循环的产物又作为下一个循环的模板，每循环一次，DNA分子就按2n指数倍增，结果可获得数百万个拷贝的目的DNA片段 PCR原理 谢 谢 五、单克隆抗体 (monoclonal antibody)（一）概念 通过克隆单个分泌抗体的B淋巴细胞，使之分泌大量的均一的抗体，即单克隆抗体。 （二）方法 （二）方法 X 让细胞繁殖，并检测抗x抗体，阳性克隆提供抗x抗体 每孔一个细胞 检测上清液中x抗体并用阳性细胞克隆 在选择培基中只有杂交瘤细胞能生长 细胞融合（两种亲本细胞的特性） 小鼠骨髓瘤细胞（正常培基中能无限存活选择性培基中死亡） 分泌某抗体的B细胞 （寿命有限） (三) 单克隆抗体的用途 1.有高度的特异性和灵敏性,为肿瘤等疾病的免疫治疗开辟了新途径. 2.单克隆抗体技术与基因克隆技术相结合,为分离和鉴定新的蛋白质和基因开辟了一条广阔的途径 冰冻蚀刻方法 将样品用液氮超低温冷冻，置于真空蒸发仪中，利用特殊的断裂装置将冷冻后的样品骤然断开，当断裂面的冰升华（蚀刻）后，就浮雕出细胞的亚微结构。再喷涂铂与碳制作断面复型膜，最后在腐蚀液中除去样品，剩下的碳铂膜就是复型膜，打捞在铜网上，就可在电镜下观察。 通过对复型膜的观察，可得到细胞断面结构生动的立体浮雕图像。 细胞培养内面的冰冻蚀刻电镜照片示Clathrin衣被 3.细胞培养的条件 空间：无菌条件 设备：二氧化碳培养箱、离心机、冰箱、超净工作台、液氮容器等 器皿：玻璃或塑料的培养瓶、皿、板、吸管等 试剂：培养基、血清、各种添加因子等 温度、 pH值 4.贴附型培养和悬浮型培养 贴附型：能在玻璃或塑料瓶壁上平展 生长，形成单层细胞层。 如上皮型细胞、 成纤维型细胞等。 悬浮型：不贴附于支持物上， 呈悬浮生长，胞体呈球形。 如淋巴细胞等。 5.原代培养和传代培养 原代培养（primary culture） 1）概念 直接取材于有机体组织的细胞培养。 2）步骤 取材→剪碎→ 胰酶消化将细胞分散→置合适的培养基培养，一般数小时即可贴壁生长、增殖，直到相互接触铺满瓶壁，形成单层细胞。第一代细胞称为原代细胞。 传代培养（secondary culture） 将原代培养的细胞取出，以1:2以上的比例转移到另一盛有新鲜培养液的器皿中进行培养的过程称传代培养。用这种方法可重复传代。 接触抑制（contact inhibition） 一般分散的细胞悬液在培养瓶中很快就贴壁铺展并进行分裂繁殖，形成紧密的单层细胞，当这些细胞表面互相接触时，就停止分裂增殖，不再进入S期，这种现象称细胞的接触抑制。 6.细胞系 (cell line) 概念 在偶然情况下，培养的细胞中产生了具有无限繁殖能力的变异细胞，这种细胞可被无限地传代，称为细胞系。 常 用 细 胞 系 细胞系 细胞类型 来源 3T3 成纤维细胞 小鼠 BHK-21 成纤维细胞 仓鼠 Hela 上皮细胞 人宫颈癌 PTK1 上皮细胞 袋鼠 L6 成肌细胞 大鼠 SP2