ch02植物原生质体的分离、融合及培养.pptVIP

原生质体培养初期的细胞分裂至少涉及到以下多个因子： 细胞壁的再生 细胞骨架的修复与调整 原生质体分离时细胞所处的周期（G2期细胞具有较高的分裂频率） 细胞壁的再生与DNA的合成协调与否也会影响细胞分裂。 六、原生质体培养研究的趋势 培养方法：低密度和单个原生质体培养； 原生质体衍生系统如微小原生质体、胞质体、核质体的利用； 单倍配子体如花粉原生质体培养； 计算机控制系统、流式细胞光度计等技术的应用。 Section 3 原生质体的融合 原生质体融合protoplast fusion，即体细胞杂交 一、原生质体融合概念及发展 原生质体融合：是指将植物不同种、属，甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。 植物细胞杂交的几个重要进展 1960年，Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功； 1970年，Power首次用硝酸钠进行为诱导剂进行了较大规模的原生质体诱导融合； 1971年，Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株； 1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这也是第一个植物细胞杂种； 1974年，Kao将聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术； 1978年，Melchers获得了第一个属间细胞杂种（番茄＋马铃薯）； 1981年，Zimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念； 1987年，Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程序。 原生质体融合的类型 根据融合时细胞的完整程度，可分为两大类： （1）对称融合（symmetric fusion）即两个完整的细胞原生质体融合。 （2）非对称融合（asymmetric fusion）利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合，它可以分为三种形式。 采用方法：物理方法（常采用射线处理）、 化学处理（核－IOA、质－罗丹明）。 二、融合方法 1．PEG诱导融合 （1）PEG诱导融合的特点 优点： 融合成本低，勿需特殊设备 融合子产生的异核率较高 融合过程不受物种限制 缺点： 融合过程繁琐 PEG可能对细胞有毒害? （2）基本原理 ?? 聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)是一种多聚化合物，分子式为H(OHCH2- CH2)nOH，商品名卡波蜡(Carbowax)。实 验室用的PEG平均分子量在200－20000之 间，一般1000以下者为液体，1000以上 者为固体。 ?? 这种多聚化合物靠醚键的联结使其分子 末端带有弱电荷。 PEG的作用机理： Kao等认为， （1）PEG分子具有轻微的负极性，可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合； （2）PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。 高Ca 2+和pH诱导PEG结合诱导法 带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合。 在高Ca 2+和pH溶液的作用下，将与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。 PEG融合技术要点 1. 融合液： A 液 pH 5.8 CaCl2·2H2O 2~8mmol/l KH2PO4 0.7mmol/l 甘露醇或山梨醇 0.1~0.2mol/l PEG 25～30％ 牛血清蛋白(膜保护剂) 0.2％ B 液 pH7.0~10 CaCl2·2H2O 10~100mmol/l KH2PO4 0.5~0.7mmol/l 甘露醇或山梨醇 低渗 2. 融合原生质体的密度和比例 1×105/ml（不含PEG的A液），按1︰1混合 3. 融合方法 (1)将原生质体悬浮液均匀滴于培养皿底部，静置3-5min (2)滴加一滴A液，处理15-20min (3)滴加B液，静置10-20min (4)用原生质体培养液洗涤，500rpm离心 (5)培养 叶原生质体 下胚轴原生质体 聚乙二醇诱导原生质体融合 融合的原生质体 2．电融合法 The first report of electrofusion in 1979?(M. Senda, J. Takeda )? ?电融合仪的结构特点： （1）交变电场部分； （