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实验二 叶绿体的分离与荧光观察 低速离心分离叶绿体(差速离心) 在等渗溶液中分离 自发荧光:如叶绿素的火红色荧光 间接荧光:如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光 材料： 菠菜叶片 试剂：蒸馏水，0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(AO) 仪器：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，目镜测微尺，物镜测微尺，培养皿，滤纸，试管，试管架，移液管，滴管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管,吸水纸等 菠菜叶片(去叶脉)3g → 0.35mol/L氯化钠15ml→研磨(冰浴)→匀浆过滤(6层尼龙网)→滤液在1000rpm离心2min→弃沉淀，上清液3000rpm离心5min →去上清液→沉淀为叶绿体(混有部分细胞核)，用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮 →滴片观察 取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通光学显微镜观察。 将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片，使用荧光显微镜观察 。 冰浴上研磨，最好在冷冻离心机上进行，在室温下进行分离要迅速。(？) 叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行,以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。 离心机使用：离心管要平衡 荧光显微镜使用 利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等 因此在荧光观察时应抓紧时间,有必要时立即拍照。 在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。  1.观察叶绿体的形态结构,测量5~10个叶绿体的长轴和短轴求其平均值。 2.记录荧光显微镜下观察的叶绿体自发荧光和次生荧光现象，分析结果 普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形(2～5μm× 5～10μm)，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。 荧光显微镜下，用B(bule)激发滤片、B双色镜和O530(orange)阻断滤片的条件下 叶绿体发出火红色荧光 加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。   吖啶橙 吖啶橙（Acridine Orange，AO）是一种荧光色素，其激发滤光片波长488nm。阻断滤光片波长515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光（即着色特异性），这是由于DNA是个高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少，发绿色荧光，而RNA聚合度低，能和荧光物质结合的位置多，故发红色荧光。 用0.01%吖啶橙荧光染料对叶绿体进行染色，于荧光显微镜下观察，观察到叶绿体发橙红色荧光，说明吖啶橙与叶绿体中的什么成分结合？细胞核会是什么颜色？(黄绿色) 离心分离技术 离心分离细胞组分和生物分子是最常用的分离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，可在不同离心力的作用下沉降分离。 离心分离技术 速度离心velocity centrifugation 差速离心(differential centrifugation) 移动区带离心(moving-zone centrifugation)如蔗糖密度梯度离心 等密度离心isodensity centrifugation 差速离心 主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。 移动区带离心 这一方法需要用蔗糖或甘油制备轻微的连续密度，然后将待分离的样品加在离心管的最上层，形成一狭窄的带，再通过较长时间的离心。在离心过程中，大小、形状、密度不同的颗粒就会分开，最后收集各区带得到要分离的物质。在此方法中，分离介质对被分离的物质必须是中性无害的，并且密度梯度较低，底部的密度比管顶部的密度大，建立密度梯度的目的是防止扩散。重要的是，待分离颗粒的密度比离心管中任何部分介质的密度都要大。常用的是蔗糖密度梯度离心(sucrose density gradient centrifugation)。 移动区带离心分离 等密度离心 等密度离心分离样品主要是根据被分离样品的密度。在这种离心分离方法中，要用介质产生一种密度梯度， 这种密度梯度覆盖了待分离物质的密度，这样，通过离心使不同密度的颗粒悬浮到相应的介质密度区。在这种梯度离心中，颗粒的密度是影响最终位置的惟一因素，因此用这种方法分离颗粒，主要是根据被分离颗粒的密度差异。只要被分离颗粒间的密度差异大于1% 就可用此法分离。 蔗糖或者甘油(它们的最大密度是1.3g/cm3)通常可用于分离膜结合的细胞器，如高尔基体、内质网、溶酶体和线粒体。在等密度梯度离心中蔗糖或甘油的梯度的作用与移动区