广西大学 高级生物化学课件— 重组DNA技术讲解-2.pptVIP

重组DNA技术;第一节 概述 ;一、克隆体系：目的基因、载体DNA、工具酶、宿主细胞等 ;质粒（plasmid）：存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，在细胞中可以独立进行复制并在细胞分裂时恒定地传给子代细胞。;配伍末端（compatible end）：不同限制性内切酶产生的相同粘性末端 ;第二节 DNA克隆的基本过程;cDNA文库(cDNA library)：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有cDNA信息，总称cDNA文库 。常用于筛选编码蛋白质的结构基因。; 2、常用载体：质粒、噬菌体、病毒DNA ;六、“表达”：使克隆基因在宿主细胞中复制、表达 ;突变方法;插入突变;Distribution of Tn5gusA5 in the genome（partial）;Confirmation of TAIL-PCR determined transposon position by PCR; Strategy of pK18mob integration mutagenesis; Physical map of pK18mob;Nonpolar gene inactivation by single site integration of a homologous plasmid;Pfu Amplification of truncated fragments of target ORF ;ATG ATT ACG AAT TCG AGC TCG GTA CCC GGG GAT CCT CTA GAG TCG ACC TGC AGG CAT GCA AGC TT;整合突变体验证;; Strategy of pK18mobSacB deletion mutagenesis;sacB gene;pK18mobSacB;;;Left flank;缺失突变技术路线 1、取旁侧序列 (1.5 kb） 2、设计旁侧引物和Gm引物  (EcoR I, Kpn I, BamH I, Xba I, Pst I, Hind III) 3、扩增旁侧和Gm片段 4、酶切载体、旁侧和Gm片段 5、四片段连接，转化，Tc,Gm,IPTG,X-Gal筛选 6、以两外侧引物扩增验证和酶切验证 7、阳性克隆三亲导入Xcc 8004，Rif,Gm筛选 8、筛选Tc敏感接合子 9、PCR验证（8004、Tcr、Tcs）;概述;一、质粒的特点： 1、环状DNA，2kb～数百kb。 2、某些质粒可以重组到染色体中复制，形成附加体。; 松弛控制性质粒，拷贝数多，不受细胞内染色体控制。;;The constructed plasmid pBR322 ;常用克隆载体;An example of an E. coli expression vector;常用表达载体;噬菌体载体 ;其它类型载体 ;http://www.dsmz.de/microorganisms/plasmid_info.php?dsmz_no=6305 ;DNA Seq. 2004 Jun;15(3):225-7. Genetic and physical map of the pLAFR1 vector. Vanbleu E, Marchal K, Vanderleyden J. Centre of Microbial and Plant Genetics, Katholieke Universiteit Leuven, Kasteelpark Arenberg 20, 3001 Heverlee, Belgium. Abstract This paper presents the complete sequencing and annotation of the pLAFR1 vector. pLAFR is a tetracycline-resistant cosmid cloning vector, which is derived from the 20 kb plasmid pRK290, a RK2-derivative. Due to its broad host range, the pLAFR1 vector has been widely used in the genetic analysis of a broad number of gram-negative bacterial species. The availability of the complete pLAFR1 sequence will most definite