b第六章节植物基因工程下.pptVIP

（三）抗病毒作物 转基因植物利用一些病毒包衣蛋白基因构建了抗病毒优良品种，如：烟草花叶病毒基因组编码四种多肽：两个复制酶亚基、一个包衣蛋白、一个与细胞结合有关的蛋白。 由根瘤农杆菌介导的基因转化构建了表达。TMV包衣蛋白CP的转烟草植物，该转基因植物在TMV存在时，能抗病毒感染30天左右，正常植物3~4天之后使被TMV感染。 最近的实验结果表明，CP表达抵御病毒侵袭也在其它谷物中成功，如马铃薯、番茄、苜蓿等。 基因工程 第六章 植物基因工程 （下） 湖南科技大学生命科学学院 第六章 植物基因工程（下） 三、改进转基因的技术 转基因植物中外源基因的沉默 提高外源基因表达水平的策略 四、农作物基因工程 五、生物反应器 六、转基因植物的安全性 三、改进转基因的技术 在转基因研究中经常碰到一种引起基因失活的现象称为基因沉默（gene silencing）。 基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后3种不同的层次上： 1. 发生在染色体DNA水平上的转基因沉默叫位置效应； 2. 发生在RNA转录水平上的转基因沉默叫转录失活； 3. 发生在转录后水平的转基因沉默叫共抑制。 （一）转基因植物中外源基因的沉默 1. 位置效应 位置效应是指基因受寄主染色体基因组上的插入部位及周围核苷酸组成的影响。 如果整合发生在转录活跃的常染色体上，毗邻寄主基因的调控系列将影响到外源基因的表达； 如果插入到重复DNA或异染色体中或旁边，外源基因可能会失活。 2. DNA甲基化 植物DNA 甲基化程度是较高的，核基因组中几乎20%-30%的胞嘧啶处于甲基化状态。 外源基因编码区域的甲基化对基因表达的作用不明显，通常检测不到对转录的影响； 外源基因启动子区域或5’端非编码区域的甲基化会引起启动子失活或不能起始转录，在转录水平上诱导了外源基因的沉默。 3. 重复序列诱发基因沉默 通过电击法等将DNA直接导入植株，外源基因往往以多拷贝串联的方式整合在寄主的基因组内。 重复序列诱发的基因沉默（repeat induced gene silencing, RIGS）与重复序列间的异位配对和DNA的甲基化相关。 一般一个位点插入的外源基因的拷贝数越多，失活的程度越高。 3. 重复序列诱发基因沉默 解决方案有： 对外源基因及启动子进行改造，保证设计的序列与植物基因组有很短的同源序列，避免异位配对的发生； 使用基因枪法及电击法等直接DNA导入法容易引起多拷贝基因的插入，而使用农杆菌转化法可在一定的程度上避免多拷贝基因的插入； 在筛选作为育种材料的转基因植物时，尽量选择单拷贝插入的个体，采用RT-PCR法可以筛选到单拷贝插入的个体。 二、提高外源基因表达水平的策略 1. 转化方法的影响 基因直接转化法容易引起多拷贝转基因在寄主细胞中的整合，导致转基因沉默，而农杆菌介导的遗传转化法由于产生的拷贝数相对较少，可以在一定的程度上避免这个问题。 2. 使用信号肽 植物蛋白质分子的定向运输需要特殊多肽信号的引导作用。为提高转基因在植物的专门组织中的表达，除使用专门的启动子外，使用特定的信号肽序列是必需的。 3. 选择强启动子和诱导型启动子 选择合适的植物启动子是增强外源基因表达的一个有效手段。通常来源于双子叶植物的启动子，在双子叶植物中的表达效率要比在单子叶植物中高得多，反之亦然。 有时人们并不需要外源基因在受体植物中的高效表达，而要求其能够在转基因植物中实现特异的时空表达。这就需要使用诱导型启动子，其在特定的条件下诱导在某些器官组织中特异性地启动目的基因的表达。 4. 强终止子 在植物转化的研究中，两个常用的终止子是CaMV 35S启动子和根瘤土壤杆菌T-DNA的胭脂氨基酸合成酶基因的nos终止子。 其PolyA尾巴和其中的茎-环结构，可有效地抵御核酸酶的水解作用，使mRNA 分子保持稳定性。 5. 消除甲基化的影响 已知用5-氮胞嘧啶处理植株具有很好的抑制甲基化和脱甲基化作用。 人们还试图在载体上加上去甲基化功能的序列来防止甲基化。 6. 使用植物偏爱的密码子 转基因的密码子和植物基因组DNA的不同容易引起甲基化和表达效率低。 在遗传转化前有必要优化转基因的密码子，尽量使用一些植物偏爱的密码子。 7. 使用MAR序列 基质结合区（matrix attachment region, MAR）也叫核骨架结合区（scaffold attachment region, SAR）长度一般为300-1000bp，它可以与核骨架结合，在两个MAR 间的染色质区域可形成DNA 环，环的大小为5-200kb，每一个环为一个独立的表达结构。 利用MAR 的这一特性，可创造一个独立的结构域，减少了插入位点附近染色质的影响