03物理图谱和测序2.ppt

第三章DNA物理图谱的构建及序列测定;物理图谱（physical map）;质粒pBR322的限制图;一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） ;1.细菌的 修饰作用和限制性核酸内切酶的发现;E.coli 菌株;1962，Arber：宿主的修饰在噬菌体DNA上进行 1965，Arber：宿主对入侵噬菌体的修饰与噬菌体DNA降解密切相关；预言细菌中存在位点特异性限制酶；修饰是宿主甲基化酶作用结果：建立细菌限制-修饰（R-M）系统概念。;Arber假说;流感嗜血杆菌 （Haemophilus influenzae）能迅速降解外源的噬菌体 DNA ，其细胞提取液可降解 E.coli DNA ，但不能降解自身 DNA ，→ HindⅡ 限制性内切酶。 HindⅡ 限制性内切酶位点和切割位点如下： ????????????5 … GTPy ↓ PuAC … 3 ????????????3 … CAPu ↑ PyTG … 5 ;上世纪80年代，限制性内切酶开始克隆表达;限制-修饰系统;Smith等的工作;磷酸纤维素层析——阳离子交换层析;氨基酸的等点点（isoelectric point，pI）;离子交换层析分离蛋白质;甲基转移酶催化甲基化（methylation）;腺苷转移酶;甲基转移酶;腺苷或胞嘧啶的甲基化是多种细菌的限制修饰系统的一部份 ;真核生物中也存在广泛的DNA甲基化修饰现象 ;2. 限制性内切酶的种类与特性; 传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。然而，蛋白测序的结果表明，限制性内切酶的变化多种多样，若从分子水平上分类，则应当远远不止这三种。 ;I型限制性内切酶 ;II型限制性内切酶;IIS型限制性内切酶;III型限制性内切酶;;3.识别位点的序列测定;碱性磷酸酶;T4多聚核苷酸激酶;牛胰脱氧核糖核酸酶（DNase I）;蛇毒磷酸二酯酶;4.影响限制性内切酶活性的因素;内切酶活力单位;*DNA甲基化程度;*酶切消化反应的温度 ;*DNA的分子结构 ;位点偏爱（Site preference） ;*核酸内切限制酶的缓冲液 ; 不同的酶对离子强度的要求差异很大，并依次将限制酶缓冲液按离子强度的差异分为高、中、低三种类型，离子强度以 NaCl 来满足，浓度分别为 100mM 、50mM 和 0mM 。 ;NEBuffer 1（黄色）：10 mM Bis Tris 丙烷-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT（pH 7.0 @ 25℃）。 NEBuffer 2（蓝色）：10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT（pH 7.9 @ 25℃）。 NEBuffer 3（红色）：50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM DTT（pH 7.9 @ 25℃）。 NEBuffer 4（绿色）：20 mM Tris-Ac, 10 mM Mg(Ac)2, 50 mM KAc, 1 mM DTT（pH 7.9 @ 25℃）。;宝生物公司缓冲液;; 特殊缓冲液： NEBuffer EcoRI：50 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 0.025% Triton X-100（pH 7.5 @ 25℃） ;双酶切缓冲液选择;5.星星活性（star activity） ;二、构建物理图谱的克隆载体;①质粒载体;;②柯斯质粒;;;黏粒的特点;黏粒克隆的主要原理;;;③酵母人工染色体（Yeast artificial chromosomes YAC）;人工染色体必备结构元件;;;YAC 载体——pYAC4 ;YAC 载体的工作原理;;;YAC 载体的缺陷;缺失和插入;重排（rearrangement）;④细菌人工染色体（BAC）;F 质粒 ;;第一代 BAC 载体 （Shizuya et al. 1992） 不含能用于区分携带重组子的抗生素抗性细菌菌落与携带空载体的细菌菌落的标记物。 新型的 BAC 载体可以通过α互补的原理筛选含有插入片段的重组子，并设计了用于回收克隆 DNA 的 Not Ⅰ 酶切位点和用于克隆 DNA 测序的 Sp6 启动子、 T7 启动子 （Kim et al. 1996; Asakawa et al. 1997） 。 Not Ⅰ 识别序列，位点十分稀少。重组子通过 Not Ⅰ 消化后，可以得到完整的插入片段。 Sp6 、 T7 是来源于噬菌体的启动子，用于插入片段末端测序。 ;;BAC 载体空载时大小约 7.5kb ，在大肠杆菌中