03_基因工程载体培训讲解.ppt

三、噬菌体-质粒杂合载体 常用噬菌粒载体的一般特征 * 四、人工染色体及其应用 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb 的DNA片段， 此时柯斯质粒(45kb)和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体， 它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 或称为自主复制序列(ARS) * 四、人工染色体及其应用 人工染色体载体（artificial chromosome vector）:利用染 色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。 实际上是一种“穿梭”克隆载体，含有质粒克隆载体所必 备的第一受体(大肠杆菌)源质粒复制起始位点(ori)，还含有 第二受体(如酵母菌)染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位 点的序列，以及合适的选择标记基因。 与其他的克隆载体相 比，人工染色体克隆载体的特点是能容纳长达1000kb甚至 3000kb的外源DNA片段。 * 四、人工染色体及其应用 (一)酵母人工染色体 酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)是一类酵母穿梭载体。 YAC具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。可以接受350-400kb的外源DNA片段。 四膜虫的端粒序列 酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的选择标记 大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记 * 四、人工染色体及其应用 (一)酵母人工染色体 酵母人工染色体的使用 * 四、人工染色体及其应用 (一)酵母人工染色体 酵母人工染色体的使用 pYAC3 * 四、人工染色体及其应用 用pYAC3进行克隆策略如下： 载体用BamHI和SnaBI双酶切，形成3个片段。 移去BamHI之间的片段，留下另外两段，每一段的两端都分别是TEL序列和SnaBI位点。 被克隆的DNA，两端必须切成平末端(SnaBI是一个平末端内切酶，识别TACGTA序列)。 把三者连接起来，形成了人工染色体。 用原生质转化的方法把人工染色体转入酿酒酵母。用作宿主的菌株是双营养缺陷型Trp1-ura3- ，可以被人工染色体上的筛选标记基因恢复成Trp1+ura3+ 。 在基本培养基平板上培养，只有含有结构正确的人工染色体的转化体可以生存。 如果染色体构建错误，如在被克隆的DNA两侧连接了相同的两段载体DNA片段，则因缺少一种筛选标记，使得转化体不能在基本成分培养基上存活。 外源DNA的是否插入，可由SUP4的插入失活判断，即可以很简单地由菌落的颜色看出：红色的菌落是重组体，而白色的菌落则不是。 * 四、人工染色体及其应用 (二)细菌人工染色体 （bacterial artificial chromosome，BAC) 细菌人工染色体通常是在大肠杆 菌性因子F质粒的基础上构建的，其装 载量范围在50 - 300 kb之间。 pBACs主要适用于： 克隆大型基因簇（gene cluster）结构 构建动植物基因文库 缺点：会出现插入片段在结构上的不 稳定，导致克隆DNA部分的缺失或重排。 * 四、人工染色体及其应用 (三)P1派生人工染色体 结合了 P1 载体和 BAC 载体的最佳特性，包括阳性选择标记 sacB 及噬菌体 P1 的质粒复制子和裂解性复制子。 (四)哺乳动物人工染色体 * 第三节 表达载体 表达载体的特征 质粒表达载体 病毒表达载体 * 一、表达载体的特征 克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可； 表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体有复制子+强启动子； 穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。 * * 1、表