浅玫瑰色链霉菌产壳聚糖酶发酵工艺及其优化.docVIP

浅玫瑰色链霉菌壳聚糖酶罐发酵工艺及其优化 王剑1,2，蒋霞云1,2，卢梦琪1,2，王宗继3，李进国3，王正碧1，孔仪1 (1. 上海海洋大学 食品学院，上海201306； 2. 上海市水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；3. 山东卫康生物医药科技有限公司，山东临沂276017) 摘要：发酵罐装填系数0.6，控制罐压0.08Mpa，采用单因素试验方法考察搅拌转速、、接种量和通气量个因素对壳聚糖酶发酵的影响。根据试验结果确定该菌种10L发酵罐发酵条件：搅拌转速20r/min，OD600=0.8~1.0，通气量2.0vvm，接种量3%发酵周期56，酶活力在52达到最大，为35.2±0.5）U/mL。补料工艺发酵周期为64，酶活力在60达到最大，为46.4±0.5）U/mL。补料工艺能维持产酶期菌丝形态和延长产酶时间，从而提高产酶，最终补料工艺比批次发酵产酶提高了32%。该研究为壳聚糖酶工业化生产奠定基础。 10L）工艺参数，并对补料工艺进行了探索，最终发酵液酶活力达46.4±0.5U/mL。 关键词：壳聚糖酶，发酵工艺，链霉菌 壳聚糖酶（EC32）是一种能作用于壳聚糖β-1,4糖苷键的水解酶，从而获得低聚合度的壳寡糖[1]。壳寡糖有良好的水溶性，具有降血糖、降血脂、抗真菌、抗细菌以及抑制肿瘤生长等功效[]。目前，生产壳寡糖主要有酸解法和酶水解法。酸水解壳聚糖反应剧烈，产物复杂，提高了后续的分离提取的成本，且污染问题不可忽视。而酶水解法以高效率，低能耗等优点而成为生产壳寡糖的主要方法[]。 壳聚糖酶来源广泛，国内外学者已从自然界中分离出多株性能不同的壳聚糖酶生产菌株，并在壳聚糖酶的性质研究及其应用等方面开展了许多工作 []。浅玫瑰色链霉菌为本课题组前期实验分离得到，具有产酶量高、发酵周期短及单一内切型酶等特点，有潜力成为工业化生产菌株[]。本文旨在研究该菌种的发酵工艺，进一步提高其产酶能力，为其工业化生产的潜力释放提供理论基础。 1.1 实验菌种 本实验室分离，经鉴定为treptomyces roseolus，DH) [7]。 1.2 培养基 平板分离培养基，液体种子培养基[]。 发酵培养基组分组成（%，W/V）：K2HPO4 0.07，NaCl 0.5，KH2PO4 0.03，MgSO 4·7H2O 0.05，酵母粉0.5，蛋白胨0.5，胶体壳聚糖1.0，调pH至7.2。 1.3 主要仪器 SFY10L 液体发酵罐，Inpro 6800，T6新世纪紫外可见分光光度计，Nikon ECLIPSE 80i显微镜。 菌体干重(Dry Cell Weight，DCW)。 准确量取一定量的发酵液经5000r/min离心15min后，取沉淀用2倍发酵液体积的稀盐 收稿日期： 2015-03-29 修回日期： 基金项目：上海市科学技术委员会工程巾心建设项目(11DZ2280300) 作者简介：王剑(1990一)，男，硕士研究生，研究方向为应用化学。E-mail：wangjian5133@163.com 通信作者：蒋霞云，E-mail：jiangxy@ 酸溶液(pH=5.0)洗涤3次，最后用去离子水清洗数次后，烘干至恒重后测定菌体干重。 1.4.2 壳聚糖酶活力 以胶体壳聚糖为反应底物，反应体系为：0.3乙酸缓冲液pH5.6)1mL，pH为5.6的1%胶体壳聚糖溶液0.9mL和发酵液上清液0.1mL。反应液60水浴15min后，立即加入1.5mLDNS试剂，摇匀后置于沸水浴中反应5min，反应结束待自然冷却后补水至25mL、混匀再5000r/min离心5min，取上清液测定。对照组为加入煮沸灭活的发酵上清液[]。酶活力单位：以每分钟产生相当于1μmol氨基葡萄糖的还原糖所需酶量定为1个酶活力单位（U）。 相对酶活力是指在发酵产酶影响试验中因子各水平发酵液的酶活力与该因子最高产酶水平发酵液的酶活力的比值。 经在1000倍显微镜下观察菌体形态每一份取样的发酵液制作9份染色样品，共采集约50个图片，对每个图片进行观察分析获得菌丝形态典型特征，进而分析菌丝在发酵过程中的分化规律和变化趋势。 采用动态法测定发酵过程中耗氧速率和体积传氧系数[12]。在发酵过程中暂停通气，同时保持发酵罐压力不变，通过溶氧电极可记录发酵罐内溶氧变化曲线，根据停止通气过程中溶氧曲线的斜率该时刻发酵罐内微生物耗氧速率OUR)，在已知耗氧速率的情况下，可通过重新通气过程中溶氧速率来计算体积传氧系数KLa。在发酵过程中可根据溶氧及其变化速率计算任一时刻发酵过程中的菌体摄氧速率。 式中：是指重新通气过程中发酵液中溶氧的变化速率；C*是指在发酵条件下的饱和氧分压。以为纵坐标，C*-C0为横坐标作一条直线，该直线的斜率即为