【DOC】-质粒DNA中宿主菌基因组DNA残留检测方法的比较.docVIP

质粒DNA中宿主菌基因组DNA残留检测方法的比较 ??中国生物制品学杂志2009年1月第22卷第1期ChinJBiologicalsJanuary2009，Vol.22No.1中国图书分类号Q789 ??文献标识码Ａ文章编号1004-5503（2009）01-0085-03 ??·８５· ??【实验技术】 ??质粒DNA中宿主菌基因组DNA残留检测方法的比较 ??徐向明１ ??张泉２ ??PCR ??【摘要】目的对检测质粒DNA中宿主菌基因组DNA含量的Southernblot和Real-timePCR法进行比较。方法 ??扩增宿主菌染色体DNA的16SrRNA片段，以地高辛标记回收的目的片段为探针，对提取的质粒pcDNAH进行Southernblot，同建立Real-timePCR反应体系和标准曲线，分别检测质粒中宿主菌基因组DNA的含量。结时根据16SrRNA基因序列设计探针， ??果应用Southernblot和Real-timePCR检测质粒pcDNAH中宿主菌基因组DNA的含量，结果均符合WHO相关标准。结论两种检测方法各有优缺点，均可用于检测质粒DNA中宿主菌基因组DNA的残留，可根据不同情况，采用不同方法或配套使用。 ??【关键词】质粒DNA；宿主菌；Southernblot；实时PCR ??ComparisonofTwoMethodsforDeterminationofResidualHostGenomicDNAinPlasmidDNA ??XUXiang-ming△,ZHANGQuan（△JiangsuAnimalHusbandryandVeterinaryCollege,Taizhou225300,JiangsuProvince,China） ??【Abstract】Objective ??Tocomparetwomethods,i.e.Southernblotandreal-timePCR,fordeterminationofresidualgenomic ??The16SrRNAfragmentofhostE.colichromosomewasamplifiedbyPCR,labeledwithdigoxin ??DNAinplasmidDNA.Methods ??andusedasaprobeforSouthernblottingwithplasmidpcDNAHextractedfromrecombinantE.coliDH5α.Meanwhile,aprobewasdesignedaccordingtothegenesequenceof16SrRNAandusedfordeterminationofhostgenomicDNAbyreal-timePCR,basedonwhichastandardcurvewasplotted.Results ??BoththeresidualhostgenomicDNAcontentsinplasmidpcDNAHdeterminedby ??BothSouthernblotandreal-timePCRweresuit－ ??Southernblotandreal-timePCRmettherelevantWHOrequirements.Conclusion【Keywords】PlasmidDNA;Hostbacterium;Southernblot;Real-timePCR ??ableforthedeterminationofresidualhostgenomicDNAinplamidDNA,whichmaybeappliedaloneorincombination. ??人基因免疫／治疗用重组质粒DNA的质量要求十分严格。根据WHO的相关规定［1］，符合体内使用质量标准的质粒制品中，宿主菌基因组DNA的含量必须小于10ng／μg质粒DNA。从细菌发酵培养到质粒DNA纯化整个过程，由于酶解和机械剪切力的作用，宿主菌基因组DNA非常容易断裂，在最终的质粒纯化产物中，或多或少都会存在一定量的基因组DNA［2］。宿主菌基因组DNA片段、大分子量RNA（尤其是核糖体RNA）和非超螺旋质粒均不利于真核细胞的基因转染［3］，因此，依据相关质检部门的规定，一定要采用灵敏、准确、可靠的方法检测样品，以确保质粒DNA的质量。本研究以大肠杆菌的16SrRNA基因片段为研究对象，以地高辛（DIG）标记和依赖于TaqMan探针的Southernblot及Real-timePCR检测方法同时检测质粒制品中宿主菌的DNA含量，现将结果报道如下。 ??基金项目：江苏省高校自然科学研究计划（04KJB230161）.作者单位：1江苏省畜牧兽医职业学院（泰州225300）；2扬州大 ??