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生命科学基础实验教学示范中心 ;第一章 蛋白质（酶）、核酸的分离纯化;第一章 蛋白质（酶）、核酸的分离纯化; 第一节 引言; 性质 方法 分子大小 透析、超滤、差速离心、凝胶过滤 溶解度 等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀 电荷 电泳、离子交换层析 吸附性质 吸附层析 对配体分子 的生物亲和力 亲和层析;一、分离纯化的意义;;二、分离纯化的要求;三、分离纯化的一般程序;第二节 蛋白质（酶）、核酸 分离纯化的前处理;二、细胞的破碎;组织细胞的破碎方法很多，根据不同的实验规模，不同的实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同。 一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎； 植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的； 细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。 ;;三、细胞器的分离;四、提取;1、蛋白质（酶）的提取;2、核酸的提取;蛋白质的去除可以选择去污剂法或有机溶剂法。 去污剂法是利用SDS等阴离子去污剂与蛋白质带正电荷的侧链结合，从而使核酸与蛋白质分开。然后加入浓醋酸钾溶液，使SDS-蛋白质复合物沉淀，并使多余的SDS转化为溶解度小的钾盐而同时沉淀。 有机溶剂法是利用酚、氯仿的混合液作蛋白质的变性剂，当它们与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形成乳状液，蛋白质因充分接触酚和氯仿而变性，与核酸分开。离心后可分为两相，一般上层为含核酸的水相，下层为有机相，交界处是变性凝聚的蛋白质层。最后利用乙醇或异丙醇将核酸沉淀离心收集即可。;第三节 分离纯化;一、粗提纯1.　蛋白质的粗提纯;（1）盐析; 不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质中盐的浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：;（2）等电点沉淀;（3）有机溶剂法; 室温下，这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却，然后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中，防止有机溶剂局部浓度过高，则在很大程度上解决变性问题。 不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。 ;2.　核酸的粗提纯;二、精提纯 1.　蛋白质精提纯;核酸样品进行精提纯，一般常用超离心、电泳、柱层析等方法。 超离心包括速度区带离心、沉降平衡超离心。 电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖电泳。 前者凝胶孔径小，适合分离1000个核苷酸以下的核酸分子。后者孔径大，适合分离较大的核酸分子。 柱层析主要有凝胶过滤柱层析、离子交换层析、羟基磷灰石柱层析。;三、 纯度鉴定;核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法（A260/A280）等方法。 同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用2-3种方法才能确定。;第四节　生物大分子的浓缩、干燥及保存 　　一、浓缩 　　　　1.吸收法 　　　　2.超滤法 　　二、干燥 　　　　1.真空干燥 　　　　2.冷冻真空干燥 　　三、样品的保存 　　　　1.干态保存 　　　　2.液态保存; 离心技术概论 一般制备离心 超离心技术;台式高、超速离心机 0.6-10万rpm;一般制备离心;;?高速冰冻离心机;科研人员将采集的脐带血放置到低温超速离心机内进行技术处理;应用范围： ■病毒及亚细胞组份分离 ■蛋白梯度分离 ■脂蛋白分离 ■RNA梯度沉淀 ■质粒DNA提纯 ; 制备性超速离心主要利用离心机转子高速旋转时所产生的强大离心力，加快颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数或浮力密度差的物质分开。 沉降系数指单位(cm)离心场中颗粒沉降的速度，用s表示，其单位是1×10-13秒，简称S，即1S＝1×10-13秒。 沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。 制备超离心的关键是如何根据颗粒和介质的性质以及转子的某些参数来确定转速和离心时间。 颗粒沉降的时间和速度取决于：离心力、颗粒的大小形状和密度、沉降介质的密度和粘度。;一、原理和计算 （一）离心力和相对离心力 当离心机转头以一定的角速度w（弧度/秒）旋转，颗粒的旋转半径为r（厘米）时，任何颗粒均受一个向外的离心力，此离心力为：