荧光光谱在蛋白质结构中的应用.pptVIP

总结 T rp、Tyr 以及Phe 由于其侧链生色基团的不同而有不同的荧光激发和发射光谱。其中T rp 的荧光强度最大, Tyr 次之, Phe 最小。因为蛋白质的荧光通常在280 nm 或更长的波长被激发,Phe 在绝大多数实验条件下不被激发, 所以很少能观察到Phe 的发射。这样蛋白质的内源荧光主要来自T rp 和Tyr 残基。T rp 残基对微环境的变化很敏感, 并且大多数蛋白质中都含有几个不同种类的T rp 残基, 而且在Trp存在的条件下，Tyr吸收的能量常常不是自己通过荧光发射释放出来，而是传递给Trp，由Trp发出荧光。因而常将Trp作为内源荧光探针来研究溶液状态下蛋白质的构象。 对实验准确性的一些影响因子 环境 溶剂 温度 pH 环境极性的影响 光谱在极性溶剂中蓝移 Tyr的吸收在极性溶剂中更加微弱 溶剂的吸收 温度 荧光一般随温度上升而减弱，所以荧光实验需要恒温 Tyr的吸收谱与pH有关 没有考虑Tyr在蛋白质的外部还是内部 与环境的极性有关 主要参考文献 王守业; 徐小龙; 刘清亮; 解永树：荧光光谱在蛋白质分子构象研究中的应用；化学进展（Progress In Chemistry）;2001年 04期; 南开大学物理科学学院生物物理系09级硕士研究生翟耀绪在分子生物物理课上所作报告的总结 南开大学物理科学学院生物物理系李树杰教授所赠相关文献片段 （美）韦弗 著，郑用琏等编译：《分子生物学（第三版）》，科学出版社，2008年版 荧光光谱在蛋白质结构中的应用 李强 0710219 黄雄 0710209 李承珉 0710214 蛋白质结构的研究方法 1.测定溶液中的蛋白质分子构象。如核磁共振法,圆二色谱法, 激光拉曼光谱法, 荧光光谱法。 2测定晶体蛋白质的分子结构。如X射线衍射分析法。 两者的共同之处是可以用蛋白质溶液进行测量，而且不破坏蛋白质的结构。 荧光光谱法的优点 荧光光谱法是研究蛋白质分子构象的一种有效方法。它能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数, 这些参数从各个角度反映了分子的成键和结构情况。通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断蛋白质分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明蛋白质结构与功能之间的关系。同时, 荧光光谱法还具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便等优点。所以, 该方法在蛋白质分子构象研究中得到越来越广泛的应用。 荧光光谱的测量原理 光是一种电磁波。它的频率与波长的关系为： ν=c/λ (1) 式中ν为频率、λ为波长、c为光速。 荧光光谱的测量原理 当光进入某种物质以后，可以有两种情况发生： 一种是进入物质后，能量几乎不被吸收； 另一种是能量被全部吸收或被部分吸收。 在后一种情况下，在吸收光的过程中，光能被转移给分子。但是吸收本身是一种高度专一的现象，即一定结构的分子只能吸收一定能量的辐射。根据量子理论，分子从光波中吸收能量必定是以不连续的、整份单位的形式发生，这些不连续的微小能量单位称为量子。 荧光光谱的测量原理 也就是说频率为ν的单色光的能量必定是 hν的整数倍。每个量子能量为： E=hν=h c/ λ=hcw (2) h为普朗克常数、w为波数。 可见，能量E与波长λ成反比，波长越长，能量越小 荧光光谱的测量原理 吸收光谱和荧光光谱能级跃迁示意图 荧光光谱的测量原理 光照射物质时，光子打到分子上，大约在10-15秒内被吸收，原来处于基态的电子被激发到较高的能级，从而使分子处在激发态。此后，激发态分子通过内转换过程把部分能量转移给周围分子，使较高激发态的电子很快回到最低激发态的最低振动能级（亦称第一单线态）。处在第一单线态的分子的平均寿命是10^-8秒左右。如果这种分子通过发射出相应的光子而回到基态的各个不同的振动能级，即可产生荧光，根据回到的振动能级的不同，荧光的波长就不同，从而形成荧光发射带光谱。由于发射荧光前已有一部分能量被消耗，所以发射荧光所相应的能量要比物质吸收的光能量小，故而荧光的发射特征波长总比激发特征波长长。 荧光光谱的相关概念 1、激发光谱 2、发射光谱 3、荧光寿命和荧光量子产率 4、荧光强度与溶液浓度的关系 1、激发光谱 激发光谱是指引起荧光的激发辐射在不同波长的相对效率。把荧光样品放入光路之后，选择合适的发射波长与狭缝宽度，并使之固定不变，然后令激发单色器扫描，即可得到激发光谱。激发光谱的形状与选择的发射波长无关，但其相对强度与所选择的发射波长有关。发射波长固定在它的峰位时，所得的激发光谱最大。 2、发射光谱