医学电子显微学的研究方法.pptVIP

九 载网与支持膜 (coppergrid asupport film） 1. 载网 载网和支持膜用来支撑切片的样品，有金属载网、铜网和 镍网，直径在2-3mm，网格为100-300目。 (1)大孔载网，电子束透过率高，支持性差，适用于低倍大视 野观察 (2)小孔载网，电子束透过率低，支持性好，适用于高倍高分 辨观察 (3)镍网适用于免疫电镜。 铜 网 的 类 型 ： 1－3 150目 4－6 200目 7 300目 8 - 9 单 孔 10－12 多缝 2 支持膜 生物样品对电子轰击的耐受力弱，要在铜网上覆盖一层支 持膜。 支持膜没有结构，薄透明易被电子束穿透A3、机械强度大, 耐电子束轰击，与样品不发生化学反应。 厚度在150?。 formva 膜： 化学名称是聚乙烯醇缩甲基机械强度高。 formva 膜的制备 十 电子染色 (positive staining) 1. 电子染色的概念 用重金属盐与细胞内成份结合，在电子束的照射下，形成不 同的散射能力达到染色的目的。 2. 电子染色的原理： 细胞和重金属盐结合，不同结构吸附重金属原子数量的能力 不同，结合较多的区域具有大的电子散射能力,反差强.结合 少的或没有结合的区域为透明区。通过电子染色提高图像的 清晰度。 3. 染色剂 醋 酸 双 氧 铀 显示蛋白质、核酸和胶原纤维。 具有放射性和化学毒性。染色7分钟，35℃ 枸 橼 酸 铅 对膜结构和脂肪染色好。 容易和空气中的二 氧化碳结合产生碳酸铅，污染样品。染色 10分钟 第二节 SEM生物样品制备技术 1. 生物样品的特点 生物样品含水量大 质地软、干燥脱水易变形、机械强度低， 不能耐受电子束轰击、生物组织是由原子序数较低的元素组 成，二次电子发生率低。 2. SEM生物样品制备程序 取材- 清洗 - 固定 - 脱水 - 干燥 - 镀膜 - SEM 3 取材 取材的要求： 准备好药品和器材 取材部位要准，大小要合适。 器材要锋利 几种特殊组织取材 培养细胞取材、有金属材料组织取材、菌类的取材、血液材料取材。 4 样品的清洗 一般的组织用生理盐水（如血液、粘液、分泌物） 胃肠道的粘液，用蛋白水解酶。 培养细胞清洗用培养液 内耳螺旋器的胶质膜用盐酸浸泡。 乳腺组织用乙醇和甘油处理。 5 清洗的方法 一般把样品放入小瓶，加入足量清洗液，按一定方向轻轻摇动小瓶。 表面粘液多可用注射器加压冲洗。 超声清洗法 灌流清洗法 6 样品固定 采用戊二醛、锇酸双重固定法。 7 脱水 利用乙醇梯度脱水。 8 样品干燥处理 空气干燥法：样品在空气中自然干燥。 真空干燥法：样品在真空喷镀仪中抽真空干燥。 冷冻干燥法：样品用液氮冷冻后，在真空喷镀仪中抽真空干燥。 临界点干燥法：样品在临界状态下无表面张力，干燥样品型变最小。 9 叔丁醇冷冻干燥法 T-Buthano 叔丁醇是一种有机溶剂，它的溶点为25.5℃。将样品入放 于温度在5-50 ℃ 的干燥仪内使用T-Buthano增强渗透和冷 冻样品。T-Buthano冷冻降温至10℃左右变为固态，然后加 温并使叔丁醇逐渐升华变成气态，达到干燥的目的。 10. 样品的粘胶 目的： 保证样品不移动，防止脱落，尤其在倾斜和旋转时，增强 样品的导电性。 方法： 防止涂胶过多而掩盖要观察的结构 粘贴样品前，确认观察面向上。 经干燥处理后的样品，脆而易碎，粘贴 时动作轻柔，防止 反复夹持样品 样品粘贴后，待导电胶干后再金属镀膜。 11. 样品导电 离子镀膜法 （离子溅射 Ion coating） 其工作原理是在镀膜机真空罩的顶部和底部分别装有阴极和 阳极，阴极的表面有一金属靶，样品放在阳极上。当罩内真空度达到1×10- 2托低真空时在 两极间加以1