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实验一IEF/SDS—聚丙烯酰胺凝胶双向电泳 随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入 了后基因组时代在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能 基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。自从澳大 利亚学者Wilkins和Williams等人于1994年提出蛋白质组 (Proteome)这一概念以来,国际上蛋白质组研究进展十分迅速, 不论基础理论还是技术方法,都在不断进步和完善。相当多种细 胞的蛋白质组数据库已经建立,相应的国际互联网站也层出不 穷。1996年,澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中 心:Australia Proteome AnalysisFacility(APAF)。丹麦、加 拿大、日本也先后成立了蛋白质组研究中心。在美国,各大药厂 和公司在巨大财力的支持下,也纷纷加入蛋白质组的研究阵容。 国内从1997年开始开展蛋白质组研究，已建立起基本蛋白 质组平台技术的有中国科学院上海生命科学研究院蛋白质组研 究中心和军事医学科学院。目前年我国的蛋白质组研究进入了 一个迅速发展的新阶段,其主要标志是国家科技部将蛋白质组研 究确立为“973”和“863”的项目。 蛋白质组学一经出现,就有两种研究策略。一种可称为“竭 泽法”,即采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能 多乃至接近所有的蛋白质,这种观点从大规模、系统性的角度来 看待蛋白质组学,也更符合蛋白质组学的本质。但是,由于蛋白 质表达随空间和时间不断变化,要分析生物体内所有的蛋白质是 一个难以实现的目标。另一种策略可称为“功能法”,即研究不同 时期细胞蛋白质组成的变化,如蛋白质在不同环境下的差异表达, 以发现有差异的蛋白质种类为主要目标。这种观点更倾向于把 蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法。 一、实验原理 聚丙烯酰胺双向电泳是一种由任意两个单向聚丙烯酰胺 电泳组合而成的，在第一向电泳后再与第一向垂直的方向上 进行第二向电泳的分离方法。其基本原理是第一项基于蛋白 质的等电点不同在pH梯度胶内等电聚焦(Isoelectricfocusing )； 第二项则根据分子量的不同大小进行ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分离,把 复杂蛋白质混合物中的蛋白质在二维平面上分开。经过电荷和 质量两次分离后,可以得到蛋白质分子的等电点和分子量 信息。 IEF/SDS双向电泳法是O′Farrall和Klose分别在1975年根据不 同组份之间的等电点差异和分子量差异建立的。采用IEF/SDS分离蛋 蛋白质，第一向IEF/SDS所用的聚丙烯酰胺凝胶通常为柱状，第二向 SDS所用的为板状。IEF/SDS与IEF和SDS的区 别在于： 1. 第一向的电泳分离系统与相应的单向电泳不同。在进行第一向IEF- PAGE时，为保证被分离的各种蛋白质能够充分地与SDS结合以利于第二向 SDS的进一步分离，必须在第一向电泳系统内加入高浓度的尿素和 适量的的非离子去污剂NP-40，而且溶解蛋白质样品的溶液中除了加入这两 种试剂外还含有二硫苏糖醇(DTT)。这些试剂本身并不带电荷，不影响各蛋 白质原有的电荷量和等电点，其作用在于破坏蛋白质分子内的二硫键，促使 蛋白质变性和肽链舒展，从而有利于蛋白质分子在较为温和的条件下与SDS 充分结合。 2. 第二向的加样操作与相应的单向电泳不同。经过第一向 IEF，蛋白质在第一向的凝胶柱内得到了初步的分离。 在进行第二向SDS-PAG时，其加样方式是将第一向电泳后的凝 胶柱包埋在第二向的凝胶板内，通常包埋于凝胶板的上端。由 于第二向的电泳分离系统不同于第一向，因此必须将第一向电 泳后的凝胶柱在包埋于第二向凝胶板之前，预先在第二向的电 泳分离系统内进行震荡平衡。所用的平衡液通常与单向SDS- PAG所用的蛋白质样品处理液相一致，内含?-巯基乙醇和SDS 等。经过震荡平衡，凝胶柱内原有的第一向分离系统被第二向 的电泳分离系统所取代。其中?-巯基乙醇使蛋白质组分分子的 二硫键保持还原状态，有利于SDS与蛋白质充分结合，从而完 成第二向SDS的样品处理，即可进行第二向电泳。 二. 实验步骤 蛋白质提取：称取0.2g花生胚脱脂粉，加入１ml样品裂解液，冰浴中 充分研磨， 4℃、12000g离心10min，上清液置-20℃下备用。 １．试剂配制： 第一向试剂： 1）样品裂解液(内含9.5mol/L尿素、2%非离子型去污剂NP-40、0.8% Ampholine pH5-7、0.8%Ampholine pH6-8、0.4% Ampholine pH3.5-10、2% 二硫苏糖醇、5 mmol/L K2CO3)：取5.7g新鲜尿素，2ml 10%非离子型去污剂 NP-40，0.2ml