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DNA合成概述 合成方法 磷酸二酯法 磷酸三酯法 亚磷酸三酯法 亚磷酰胺法 合成原理 引物的纯化 化学合成DNA失败序列的累积 agc tag cta g 91% gct agc tag 1% cta gct ag 1% tag cta g 1% agc tag 1% gct ag 1% cta g 1% tag 1% ag 1% g 1% 纯化方式 　 引物的OD数如何定量？ DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用水稀释到1ml测OD260值。需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。 例如，验证标2OD引物量是否准确，简单的做法是： 加入1ml水，彻底溶解混匀后，取100ul, 加入900ul水，用光径为1cm的石英比色杯，波长260nm, 此时光吸收的读数为0.2。 引物的琼脂糖电泳定量（×） 引物都是单链DNA 如何计算引物的浓度？ 粗略计算： 引物的纯度检测 PAGE检测 HPLC检测（主要用于荧光标记引物） 毛细管电泳（CE）检测 质谱(MS)检测 OD260/OD280 从生物体提取核酸时，常用OD260/OD280来评价核酸纯度，这一判断是基于序列中A/G/C/T所占比例大致相等。 A/G/C/T的摩尔消光系数是各不相同的。 如何溶解引物？ 如何保存引物 干粉 －20℃数年，室温也可保存较长时间 溶液 －20℃半年 1年 荧光标记引物: 碱性环境，避光（棕色管）， 避免反复冻融。长期保存冻存在－20度，或者更低温度；短期保存，放在4度。荧光标记引物容易吸附，使用前振荡混匀。 所有引物都应避免反复冻融 引物分子结构 平末端PCR产物与平末端载体的连接 当前国内引物合成的主要问题 引物保存时间短 纯度低 引物之间的交叉污染 我们如何合成高质量的引物 ABI 394:适合于大OD数和修饰标记引物的合成 1000埃孔径CPG ：更高的耦连效率 高品质的合成、标记原料试剂 （美国Proligo公司 ） PAGE纯化和HPLC纯化的联合使用 试剂盒中的四种标记荧光素： Hex Rox Tamra Fam * * 偶联效率高（98%） 合成单体及中间产物稳定 CPG 引物合成的粗产物 低纯度 高纯度 C18柱脱盐 OPC纯化 PAGE纯化 HPLC纯化 不能去除失败序列 不能去除内部缺碱基序列 DMT-ON EB染色原理 nmol数 ＝ OD值 碱基数 × 100 精确计算： nmol数 ＝ （15.2×A数）＋（7.2×C数）＋（11.5×G数）＋（8.3×T数） OD值×1000 1 OD260= 33 ug/ml. 1.66 A/G/C/T各25％ 1.14 100％T 1.15 100％C 1.85 100％G 2.50 100％A OD260/OD280 碱基组成（20bases） 溶解引物用10mM Tris pH7.5缓冲液，一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。 二聚脱氧核糖核苷酸 5‘端 3’端 连接 低转化效率 PCR成功率低 非特异性扩增 克隆测序发现碱基错误概率高 片断分析有双峰现象