(精选)【医学英文课件】 聚合酶链式反应 Polymerase chain reaction (PCR)教学课件.pptVIP

Characteristics of Taq Polymerase dNTPs dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。 多次冻融会使dNTP降解。 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。 模 板 模板（靶基因）核酸——模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。 蛋白质污染 有机试剂污染 Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200mmol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， Mg2+浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 PCR条件优化 dNTPs浓度 Mg2+浓度 pH值 Taq用量 循环中每一步时间，循环数 退火温度 加入一些辅助物: PEG、BSA、甲酰胺 引物设计 PCR循环参数 预变性 94~95℃/5 min 循环（25~35） 变性 94℃/30 Sec 退火 52~60 ℃ / 30 Sec 延伸 72℃/30~60 Sec 延伸 72℃/10 Min 2~3小时完成！ PCR扩增产物分析 凝胶电泳分析 （大小？） 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 酶切分析 分子杂交 ： Southern印迹杂交 斑点杂交 核酸序列分析（突变？） PCR常见问题 假阴性，扩增不出特异带 假阳性 出现非特异性扩增带 出现片状拖带或涂抹带 几种重要的PCR衍生技术 反转录PCR技术 (RT-PCR) 原位PCR技术 (in site PCR) 不对称PCR asymmetric PCR 锚定PCR anchored PCR 多重PCR Multiplex PCR 实时定量PCR技术 Real time PCR RT-PCR 定义：Reverse transcriptase-PCR （RT-PCR）——即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞组织中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。 优点：去除了内含子序列，包含所有的编码序列（表达？）；分子较小，易于操作；半定量。 RT-PCR RT PCR 步骤： 提取样品中的总RNA 总RNA 用oligo (dT) 作引物逆转录成产生 cDNA/RNA杂交链 用一套特异的引物扩增靶基因。巢式PCR或常规 Real time PCR 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。 实时定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。 扩增与检测分开进行 使用荧光染料检测DNA 对PCR终点的DNA量进行定性或定量 使用凝胶区别不同片断大小的DNA DNA Engine 常规PCR的检测方法 实时定量PCR的原理 相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图 起点定量 终点定量 终点处检测产物量不恒定 起点量是样本中原来的DNA量，更有意义；终点量经过PCR 放大，并非研究所期望的数据。 起点定量误差小，终点定量误差大。 实时定量PCR的原理 实时荧光 PCR的检测方法 Chromo4 在扩增仪上整合荧光检测元件 使用荧光染料或荧光探针实时监测DNA产物的量 通过扩增曲线分析初始模板中特定基因的量 使用序列特异的探针区别不同的DNA 通过双链DNA的熔解曲线鉴定不同大小和序列的DNA分子 实时定量PCR的原理 Threshold line C(t) value Ct值的概念 Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。(Ct值可以通过标准曲线或经验来设定) 实时定量PCR的原