第四章细胞工程第二节动物细胞培养技术细胞培养技术.ppt

第二节 动物细胞培养技术 细胞培养的甚本概念 培养细胞的特性 培养细胞生长的条件 实验准备 常用玻璃器皿清洗 细胞传代方法 细胞计数 培养细胞活力测定 无菌操作中的注意事项 细胞冻存和复苏 2.1 细胞培养的基本概念 传代培养（观看视频）： 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 原代培养（观看视频） 从体内取出组织细胞开始培养到第一次进行传代 之前的时期。 原代培养作用：一个特征性的必然的生长阶段，组织细胞完成从体内环境到体外环境的过渡和适应过程，恢复了分裂增殖与生长发育 的能力 细胞培养：使用单个细胞悬液 组织培养：使用组织块（0.5～1立方毫米）或薄片 （厚0.2 毫米） 器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫 原代培养细胞的生命归宿 1）原代培养期 2）传代期:将原代培养物经过分割，重新接种到两个或两个以上 的 器皿内进行培养，进入传代培养期. 整个培养过程的主要时期 特点：原代培养物---------要经过反复传代 注意：传代培养期并不单指原代培养物经首次传代后的“第一代”培养 过程, 而是指由首次传代开始经反复传代一直到培养物开始衰 退之前的全部时间 3）衰退期: 衰退期不同于每一代培养细胞的停滞期。处于衰退期的细胞 以任何方法都不能阻 止其向死亡方向发展。  特点：可见细胞轮廓增强，细胞质内出现暗的颗粒样结构及空泡 状结构、胞质突起回缩,有时可脱落 细胞系 :原代培养物经首次传代成功即称为细 胞系 细胞株 :通过选择法或克隆形成法从原代培养 物或细胞系中获得具有特殊性质或标志 物 连续细胞系/无限细胞系:能够连续传代的细 胞 有限细胞系：不能连续培养的 2.2 培养细胞的特性 2.2.1 培养细胞的生长方式 1）贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞 2）悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞 2.2.2 每代贴附生长细胞的生长过程 游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期） 1) 游离期： 细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称 悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 时间：10分钟一4小时 2）贴壁期： 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 细胞如何实现贴壁生长 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的底物附着。 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团） 3） 潜伏期 此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时 4) 对数生长期： 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 5) 停止期（平台期）： 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 为什么有活力但却不再分裂？ 机制：接触抑制、密度依赖性 接触抑制、密度依赖性 定义: 细胞在生长过程中达到相互接触时停止分裂的现象。 将正常细胞因相互接触而抑制分裂的现象改称为密度依赖性的生长抑制。 为什么恶性细胞能无限增生：在相同条件下培养的恶性细胞对密度依赖性生长抑制失去敏感性，因而不会在形成单层时停止生长，而是相互堆积形成多层生长的聚集体,这种现象也说明恶性细胞的生长和分裂已经失去了控制，调节细胞正常生长和分裂的信号对于恶性细胞不再起作用。 为什么------细胞膜上有糖类和蛋白质共同构成的糖蛋白,也叫做糖被。 作用：在细胞上起识别作用. 当细胞增殖到一定程度,也就是互 相挨在一起的时候, 糖蛋白识别了这种信息,就会使细胞