(精选)血清miR-1233对肾细胞癌诊断意义课件.ppt

;肾癌病理类型： 　1．透明细胞癌(clear cell renal carcinoma) 为最常见的类型，占肾细胞癌的70%~80%。 　　2．乳头状癌(papillary carcinoma) 占肾细胞癌的10%~15%。包括嗜碱性细胞和嗜酸性细胞两个类型。　 　　3．嫌色细胞癌(chromophobe renal carcinoma) 在肾细胞癌中约占5%。　　肾癌的类型还包括集合管癌（collecting duct carcinoma）和肾癌未分类（renal cell carcinoma, unclassified）。; 肾癌无论体积大小，约80%的患者早期可无任何症状，只是在普查和因其他原因作体格检查或B超检查时才被发现其肾脏有占位病变或触摸到腹部包块。有些患者肾脏原发癌灶很小，无泌尿系或肾内症状，却首先表现出远处转移癌的症状。如发现患者腋下、腹部肿块，为找原发病灶才发现为肾癌。所以及时的了解肾癌症状是非常重要的。 但是目前还未发现用于诊断肾癌的血清标志物。 ;; Participants：我们收集了肾肿瘤患者的血清，包括肾细胞癌和良性肾肿瘤（大嗜酸粒细胞瘤oncocytoma， 血管肌脂肪瘤Angiomyolipoma），选取了非恶性疾病的手术患者作为对照组，表１，我们收集来自ＵＫＢ、ＵＫＳ、ＵＫＳ三所大学泌尿外科２００５至２０１１这些患者术前的血液样本。 从血液样本中分离出血清。 We also analyzed formalin-fixed, paraffin embedded tissue from six patients stored in the archival files of the Institut furPathologie at theＵＫＢ;RNA isolation： 提取血清中ＭｉＲＮＡ 提取病理组织切片中的ＭｉＲＮＡ; Low Density Arrays： Quantitative Real-Time PCR：;Statistical methods： real-time PCR得出的数据用SDS software v2.4分析，microRNA 水平用RQ Manager v1.2.1计算出, 数据分析用DataAssist v2.0， 数据统计用SPSS17.０软件， microRNA 水平的特异性、灵敏性用ＲＯＣ分析，;Results Phase-1: 标志物的发现 ; 载样缓冲液作用： 1）增大样品密度，以确保DNA均匀进入样品孔内 为了使样品能沉入胶孔，需加入适量的蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加比重 2）使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利 3）含有指示剂，在电场中能以可预知速率向阳极泳动;指示剂;3 琼脂糖( Agarose)凝胶的制备 ;;; 制好的凝胶;A 通常将溴化乙锭EB (0.5微克／毫升，母液10mg/ml）)渗人到凝胶和电泳缓冲液中。 B 也可??凝胶在不加溴化乙锭时进行电泳， 电泳结束后再柒DNA。在室温下将凝胶浸埋在含溴化乙锭 (0.5微克／毫升)的电泳缓冲液或水中45分钟。 C 而其他系列染色剂，例如SYBR?Green，GelRed，虽然毒性小，但价格昂贵。;溴化乙锭( Ethidium bromide, EB)染色;SYBR-Green 染色;SYBR-Green I;5、加样;6、凝胶成像;;2;DNA粗略定量;1.将准确称量的粉状琼脂糖加人已定量的电泳缓冲液中； 2.在沸水浴中或微波炉中将糊状物加热直至琼脂糖完全溶解； 3.将溶液冷却至50-60 oC，再加入溴化乙锭 (取自贮存在4 oC避光瓶中500毫克／毫升水中的母液)至终浓度为0.5微克／毫升； 5.将琼脂糖溶液灌注入制胶模具中，并立即插入梳子，使其齿在靠近胶一端的位置形成加样的孔格。 6.当凝胶完全凝固后(在室温下30一45分钟)，小心取出梳子，将胶安放在电泳槽中； 7.加恰好足量的电泳缓冲液(若需要可加0.5微克／毫升的溴化乙锭，使胶埋在溶液中深约l毫米处。 ;8 .加样 样品与载样缓冲液混合后，加样品到已浸埋在缓冲液中的凝胶孔格中。 载样缓冲液：通常制成6倍的浓缩液，与样品混合后，用微量移液器加样。 9 .电泳 电压：5v/cm，DNA向正极泳动直至溴酚蓝和二甲苯青蓝在凝胶中迁移出适当的距离。 10 .检测 紫外灯，凝胶成像系统。防止EB污染！！！;六、聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE） ;CH2=CH;;2、聚丙烯酰胺凝胶电泳分类; 2）根据凝胶溶液和电泳缓冲液对样品构象的影响，可分为变性电泳和非变性电泳两类。 非变