细胞破碎蛋白质复性和固液分离.ppt

第五章 细胞破碎、蛋白质复性和固液分离 广州大学生命科学学院 柯德森 产物提纯过程的不同决定于：对象材料、目标产物特性及对其纯度的要求； 包括两个基本阶段：初级分离阶段、纯化精制阶段。 初级分离：分离细胞和培养液，破碎细胞释放产物，溶解包含体（包涵体），复原蛋白质，浓缩产物，去除大部分杂质等过程。主要决定产物的得率。 纯化精制：在初级分离的基础上，用各种高选择性手段，主要是各种层析技术，将目标产物和干扰杂质尽可能地分开，使产物的纯度达到有关要求。主要决定产物的纯度。 总原则：控制时间、温度、pH值，减少与空气接触的机会，设计好各组分的分离顺序 第二节 细胞破碎 目的：释放细胞内含物。 分类：按照是否存在外加作用力分为机械法和非机械法。 1、高压匀浆法 组成：高压泵和匀浆阀； 作用机理：高压泵将电机的旋转运动转变成匀浆阀柱杆的直线运动，从高压室（几十兆帕）压出细胞悬浮液，经过碰撞环的撞击后改变方向从出口管喷出，使细胞经历较高的流速下的剪切碰撞发生较大的变形，从而达到破碎细胞的目的。 高压匀浆阀结构示意图 高压匀浆法动力学方程 破碎效率与匀浆阀结构、操作压力和破碎次数有关： Ln(Rm/(Rm-R))=KNPa R：单位生物量释放出的产物量（mg/G) Rm是R的最大值； K：破碎速率常数； N：破碎次数； P：操作压力； a:与微生物性质有关的指数系数。 温控和能耗 破碎率-----操作压力------温度控制-----能耗 温度对活性物质的失活作用； 能耗与操作压力有关：3.5KW/100MPa 能耗也用于温控： 23.8C/100MPa 存在问题 堵塞（不适合团块状或丝状真菌），质地坚硬如包含体易损伤匀浆阀也不适合 温度高易失活，能耗大。 2、高速珠磨法 原理：细胞和极细的研磨剂在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间及珠子与细胞之间互相剪切，碰撞，促使细胞壁破裂，释放内含物。 几种常见珠磨器 常见珠磨器举例（广东正本） 动力学方程 间歇操作: Ln(Rm/(Rm-R))=Ln(D)=Kt D=(1+K1?/J)J 连续操作 Ln(Rm/(Rm-R))=KV/f=K` 温控和能耗 采用夹套冷却的方式实现温控,效果较好; 能耗与细胞破碎率成正比; 3、超声破碎 机理：声频高于15~20kHz的超声波在高强度声能输入时可以进行细胞破碎，破碎机理尚未清楚，可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。 破碎效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。 优点：操作简便液量损失少 存在问题：使敏感物质变性失活，噪声大，大容量时效率低，应用潜力有限。 空化现象：在强声波作用下，引起气泡形成，胀大和破碎的现象。 超声波破碎仪 大功率超声波破碎仪 4、化学渗透法 作用机理：某些有机溶剂，抗生素，表面活性剂，金属螯合剂，变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性，从而使内容物有选择地渗透出来，这种处理方法叫渗透法。 问题：EDTA、甲苯、Triton X-100、盐酸胍和脲的作用机理？ 优点（相对机械破碎）： 对产物释出有一定的选择性； 细胞保持完整，碎片少，利于进一步提取； 核酸释放量少，黏度低，便于进一步分离。 缺陷： 时间长，效率低； 化学试剂有毒； 通用性差 5、酶溶法 机理：就是利用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。 常用的溶酶：溶菌酶(lysozyme)、B-1,3-葡聚糖酶(glucanase)、B-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶（protease)、甘露糖酶(mannanase)、肽链内切酶（endopeptidase)、壳多糖酶(chitinase)、细胞壁溶解酶（几种酶的复合物）等 优点： 一定的选择性； 细胞外形完整，核酸释放少，有利于进一步分离过程 缺点：（只能用于实验室） 产物抑制造成效率低下； 溶酶价格高； 通用性差， 不易确定最佳条件； 6、微波加热法 机理：微波加热导致细胞内极性物质，尤其是水分子吸收微波能，产生大量热量，使胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲裂，形成微小孔洞，进一步加热可导致细胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现裂纹。 优点：微波穿透性强，选择性高、加热效率高。 缺陷： 一般只适合对热稳定物质的分离； 被处理的物料要具有良好的吸水性； 不适于富含淀粉和树胶等的天然植物 第三节 蛋白质复性 包含体（包涵体，inclusion bodies):存在于基因工程细胞中，主要由蛋白质构成，其中大部分是克隆表达的产物，这些产物在一级结构上是正确的，但在立体结构上却是错误的，因此没有生物学活性。难溶于水，只有在变性剂溶液中才能溶解。 包含体形成原因：（比较复杂，目前尚不完全清楚。） 缺少某些协助因子（分子伴侣？？）或者由于周围物理环境（温度等）不适，使其难以连续