血清谷-丙转氨酶.ppt

血清谷-丙转氨酶 (ALT)活性的测定 实验目的 学习酶学基本原理 学习ALT活性的测定 酶学基本原理 一、酶活力 指酶催化化学反应的能力，也即酶催化某一化学反应的反应速度； 检查酶的存在用它催化的反应能不能发生来测定； 酶的活力易受到温度、PH、激活剂、抑制剂等因素影响，故测定酶活性时应保持环境因素稳定。 酶反应速度 VE测定的原理： 1、测定一定量的底物转 变成产物的时间； 2、测量单位时间内 底物的减少量ΔS/t 产物的增加量ΔP/t 注：测反应的初速度 （5%的S→P的区域） 测定方法 化学法 比色法 荧光法 NADH在340有蓝白色荧光，而NAD＋没有 电化学法 同位素法 二、酶活力单位及比活 酶的活力单位 U：特定条件下1min内将1μmol底物转化为产物所需要的酶量。（国际单位） 临床可以用约定成熟的惯用单位表示。 比活 每毫克蛋白含有的E的活力单位数 U/mg蛋白 转换数 每秒每个酶分子转换底物的微摩尔数 μmol/s ALT活性测定的方法很多，主要有两类：一是卡门氏(Karman)分光光度法，二是比色测定法。 卡门氏(Karman)分光光度法的原理如下： 比色测定法目前国内采用三种方法，即金氏法(King法)、穆氏法(Mohun法)和赖氏法(Reitman一Frankel法)。其原理完全相同。 【试剂】 (1)0.1mol／L磷酸二氢钾溶液：称取KH2PO4(A.R)13.614g，用重蒸馏水溶解后转人1000ml容量瓶中，再用重蒸馏水定容至刻度，摇匀。 (2)O.1mol／L磷酸氢二钠溶液：称取无水Na2HPO4(A.R)14.196g，用重蒸馏水溶解后转入1 000ml容量瓶中，再用重蒸馏水定容至刻度，摇匀。 【操作】 【注意事项】 实验数据及结果 ALT＝（A1-A2）/（A3-A4）×20/2.5×1/0.1 Mohun单位的定义： 每ml血清在37℃、PH7.4下与底物作用30min，每生成2.5μg丙酮酸为1 Mohun单位。 (1)血清标本不宜溶血，且最好在采血之当日进行测定。 (2)在操作时应准确掌握E作用时间、温度及试剂的pH 。 (3)若所得吸光度读数超过标准曲线的直线部分，表示酶活性过高．需将样品稀释后再行测定。 临床意义 实验讨论 为什么设定标准空白和测定空白？ E活性的表示方法有哪些？ E活性测定的原理是什么？ 赖氏法在终止酶反应后，呈色反应中不仅酶作用产物丙酮酸能与2，4-二硝基苯肼形成苯腙而呈色，而且底物α-酮戊二酸也能与2，4-二硝基苯肼形成苯腙而呈色，尽管二者在500－520nm处光吸收有较大差异，但这种呈色反应的非特异性对测定结果的影响是不可忽视的，所以赖氏法使用的底物浓度很低，与酶促反应的最适底物浓度相差甚远。在两种底物浓度中尤显偏低的是α-酮戊二酸（2mmol/L）,在此浓度下，酶促反应只能达到最大反应速度65%左右，由于底物浓度的明显不足使的酶促反应产生丙酮酸的量与酶活性间不能呈现良好的线性关系。2，4-二硝基苯肼本身在碱性溶液中也能显色，为了降低空白读数，反应时不得不使用较低的2，4-二硝基苯肼（1mmol/L）,相当于反应液中酮酸的浓度（丙酮酸和α-酮戊二酸总浓度为2mmol/L）的1/2。按反应方程式，一分子酮酸与一分子2，4-二硝基苯肼生成相应的苯腙，但至少有半量的酮酸没有与2，4-二硝基苯肼作用，在酶反应后丙酮酸和α-酮戊二酸与2，4-二硝基苯肼形成苯腙呈色存在着一个人们无法控制的机率问题，据信这是赖氏法重复性差的主要原因。另外，2，4-二硝基苯肼浓度低也是使显色反应的工作曲线弯曲的原因之一。 * * EXPERIMENT 4 （改良Mohun法） P t ΔP/t＝v 或 由于NADH在波长340nm处有特异的吸收峰，因此ALT的活性可通过NADH的消失量，即根据340nm处光密度值的减少量间接作出定量测定。ALT活性的K洲an氏单位的定义是：在分光光度法规定的条件(karman分光光度计，25℃，340nm，光径1km)下，1毫升血清每分钟使光密度值降低0.001时为1单位。这一方法特异性高，不受限制和干扰，因而准确性高。但是此法除加入ALT底物外，还需加人LDH和NADH，又需用分光光度计，因此不易为一般临床化验室推广。 此外，这三种方法中所用试剂、操作步骤及作用温度等均完全相同。不同之处在于作用时间：King法60min，Mohun法和Reitman—Frankel法30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同