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细胞培养 西安交通大学医学院第一附属医院 泌尿外科研究所 细胞培养基本知识 细胞培养的基本概念 泛指体外培养，从活体内取出组织或细胞，模拟体内生理环境，在体外建立无菌、适温和一定营养的条件，使细胞生存和生长，并维持其结构与功能的方法。 可在体外条件下依其需要设计实验方案，不受体内复杂环境的影响而研究细胞的生命活动及规律。 以产生形成培养物的方法而言，可分为细胞培养、组织培养和器官培养。 细胞培养的基本概念 细胞系 (cell line)：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系。由原细胞系分离出具有与原细胞系不同性状的细胞系称为亚系 (sub-line)。 细胞株 (cell strain)：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得特殊性质或标志，并能稳定保持这些特性的培养物为细胞株。由原细胞株分离出具有与原株性状不同的细胞株称为亚株 (sub-strain)。 细胞培养的基本概念 原代培养 (primary culture)：从体内取出组织或细胞的第一次培养。确切定义为首次成功地传代培养之前的培养为原代培养。 传代 (passage)：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 细胞培养的基本概念 贴壁依赖性 (anchorage-dependent)：细胞需贴附于底物或支持物上才能生长的性质为贴壁依赖性。 悬浮培养 (suspension culture)：细胞或细胞聚集体悬浮于培养液中增殖，这些细胞无依赖于贴附底物或支持物上生长的性质，如淋巴细胞、血液肿瘤细胞等均呈悬浮培养。 培养细胞的特性 培养细胞的生长方式 贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。如各种实体瘤细胞。 悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。如各种造血系统肿瘤细胞。 每代贴附生长细胞的生长过程 游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期） 游离期 细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 10min～4h 贴壁期 细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10min～4h贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等。 进口一次性培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）。 潜伏期 此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24h。 对数生长期 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 停止期（平台期） 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。 机制：接触抑制。 肿瘤细胞失去接触抑制，当肿瘤细胞达到一定密度后向三维空间发展，使细胞发生堆积。 培养细胞生长的条件 环境 培养环境无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件。保证细胞生存环境无任何污染、代谢物及时清除，是维持细胞生存的基本条件。 温度：370C， O2，合适的pH。 CO2：5％。 细胞的营养需要 氨基酸 维生素 碳水化合物 一些无机离子 氨基酸 氨基酸是组成蛋白质的基本单位，培养细胞时12种氨基酸时必须的：精氨酸(Arg)、胱氨酸(Cyst)、异亮氨酸(Zle)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、组氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)。 另外尚需谷氨酰胺，其可促进各种氨基酸进入细胞膜。 维生素 是维持细胞生长的生物活性物质。 必不可少的有叶酸、胭酰胺、核黄素、硫胺素、泛酸、吡多醇等。 碳水化合物 提供细胞的能量。 主要的是葡萄糖。 无机离子 细胞组成所必须并参与细胞的代谢。 如钠、钾、钙、镁、磷等。 促生长因子等物质 体外培养细胞既需要上述基本营养物质，还需要促细胞生长因子等物质才能正常生长、繁殖。 如胰岛素(1～10单位)可促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。 人工培养基 细胞在体外的生存环境是人工模拟的，除无菌、温度、空气等条件外，最主要的是培养基，是供给细胞营养和保证细胞生长组织的物质。 培养基的种类分为半固体和液体培养基两类。 液体培养基分为天然、合成和无血清培养基。 天然培养基 天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。常用牛血清。 一般而言，含5％血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死，但支持细胞生长一般需加 10％血清。 血清的作用 提供细胞生存、生长和增殖所必需的生长调节因子。 补充培养液中没有或量不足的营养成分。 含有生长基质成分使细胞易贴附在培养器皿上。 提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等。 有中和毒性物质保护细胞不受伤害。 提供蛋白酶抑制剂，保护细胞不受死细胞释放的蛋白酶的损害。 血清存在的问题 存在有害于细胞生长和繁殖的物质。如补体、免疫球蛋白和一些生长抑制因子。 成分不明确，在含血清培养基中培养的细胞所反映的