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PCR引物设计及相关软件使用 PCR引物设计 引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。 引物设计的原则 引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 一般原则 1.引物长度： 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-24 bp，但不应大于38bp，引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。 例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200 ).而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个. 较长的引物（28-35bp)，一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点 一般原则 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。  一般原则 3.引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 一般原则 4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 一般原则 5. ?G 值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端?G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间?G 值相对较高的引物。 引物的3’端的?G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（能值越高越容易结合） 一般原则 6. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。  常用的引物设计软件 Primer Premier （自动有哪些信誉好的足球投注网站）* Oligo 6 （引物评价）* Vector NTI Suit Dnasis Omiga Dnastar Primer3 （在线服务）* Primer Premier 5.0 的使用技巧简介 Primer Premier 5.0使用介绍(1) Load sequence 基本信息 引物设计界面 引物有哪些信誉好的足球投注网站选项设定 有哪些信誉好的足球投注网站结果 引物信息 引物编辑 引物编辑 Some other useful function of PP5 Enzyme Melting temperature graph GC% graph Stability 引物特异性分析 Oligo 6.44 使用说明 主要功能：专门的引物设计软件 Oligo 6.44 启动界面 3个弹出窗口 用Oligo 设计引物时的3个标准 Tm 值曲线以选取5’到3’的下降形状有利于引物引发聚合反应。 Frq 曲线宜选用3’端Frq 值相对较低的片段。 ΔG 值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低 选中引物 引物分析 首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。 引物分析 二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。 引物分析 第三项检查为GC 含量，以45-55％为宜。 第四False priming 检查 引物分析 Final PCR information Search for primer using Oligo 6.44 Online primer3 service / Open sequence file Melting temperature ?G Internal Stability Frq为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。 上游引物 下游引物 只是示意图 Key information of primer Hairpin Dimer and cross Dimer GC% Total PCR information 主要功能: 1、即引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA基序(motif)查找 4、同源性分析 Preimer Premier 启动界面 Sequence n