[自然科学]18-2凝胶层析.ppt

凝胶柱的鉴定 新装的吸附柱用适当的缓冲液平衡后，将带色的蓝色葡聚糖-2000、或者红色葡聚糖、细胞色素C、血红蛋白等物质配成2mg/ml的溶液过柱，观察色带是否均匀下降，如均匀下降，则表明柱中凝胶是均匀的，或者说柱中没裂缝和气泡，是可以使用的，否则就须重新装柱。 2. 加样：取样品液5滴即为上柱样品。将出口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰好与表面相平（不可使床面干掉），关紧出口，用滴管将上述样品缓缓地加到床表面，注意尽量不要使平整的床表面搅动，然后打开出口，让样品进入床内，直至床面恰好露出，用上法不断加蒸馏水洗涤 ，立即用试管收集，待红色流尽，换试管收集。 　 VeA、VeB：组分A、B的洗脱体积 KavA、KavB：组分A、B的分配系数 　　 Vs：A、B两组分的洗脱体积之差（又称为分离体积）Vs= VeA － VeB 　　当样品体积Vp＝Vs时，理论上的洗脱图形是两种物质恰好分开(图中Ⅲ)。但由于样品流过柱时的扩散作用，其体积会逐渐增大，致使其洗脱体积远比原来大 加样量（Vp）的确定 最大理论加样量Vp＝Vs＝Vt/2 粘度对柱层析的影响 流速对洗脱曲线的影响 3. 洗脱 各组分间的 值差异越大，分离效果越好； 差异越小,则分离效果很差，或根本无法分离 流出物用部分收集器等量或等时收集，检测后分段合并相同组分的各管流出物，得到分子量不同的各种组分 1、当Kav=0时，则Ve=Vo ，即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质全排阻，洗脱体积等于空隙体积即外水体积（图中组分Ⅰ） 2、当Kav=1时，Ve=Vo+Vi 。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内水体积之和。Ve=Vo+Vi （图中组分Ⅲ） 3、当0＜Kav＜1时，Ve=Vo+ Kav（Vi ＋ Vg ）。表示固定相中只有一部分可被组分扩散渗入，一部分被排阻，Ve即在Vo与Vo+Vi＋Vg之间变化（图中组分Ⅱ） 4、有时Kav＞1，表示凝胶对组分有吸附作用 （从内水中洗脱出来的含量下降），此时Ve＞Vo+Vi＋Vg。例如一些芳香族化合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在Sephadex G-25中的洗脱体积远超出理论计算的最大值 10．膨胀度 在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积用Vβ表示。即每克溶胀基质所具有的床体积。 Vβ = Vt / g 一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大。 11．分配系数和迁移率 分配系数(K): 是指一组分在固定相与流动相中含量的比值，常用K表示。 迁移率: 是指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离之比值，常用Rf表示。 K值大，就表明该组分与固定相结合力大，迁移率小； 反之则结合力小，迁移率大。 不同物质的分配系数和迁移率是不一样的。 几种物质之间的分配系数或迁移率,其差异程度越大，分离效果就越好。 三.凝胶层析的特点 （一）优点 ?1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体。其结 ????构稳定,所以凝胶本身不与样品发生化 ????学反应。 2.凝胶层析的操作条件较温和,不易引起生 物物质的变性,即使用来分离一些理化性 质不稳定的物质也很少被破坏。 3.样品得率高,重复性好.如果按比例扩大柱 的体积和高度,可进行大量样品的分离纯 化。 （二）缺点 1.要求样品和洗脱液的粘度很低。 2.凝胶颗粒网络孔径大小非常有限,所以可被 纯化的物质的分子量范围受到限制。 3.凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用,如 芳香族化合物与脂蛋白等。 ? 四.凝胶的结构与性能 1.葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex） 结构： 葡聚糖用交联剂1-氯代-2 ,3-环丙烷使葡聚糖之间通过醚键(C-O-CH2-CH-CH2-O-)交联 聚合而成的三维空间网状结构。 OH 1. 特点： Sephadex 的三维空间网状结构的网孔大小取决于交联度,交联度的大小可在合成Sephadex 时控制加入交联剂的百分比决定.交联剂的百分比高,交联度大,网状结构愈紧密,孔隙愈小,吸水后膨胀也愈小,机械强度高,分离物质的分子量也小。反之,交联剂的百分比低,分离物质的分子量大。G类Sephadex的型号表示每克干凝胶吸水量x10,如G-50表示每克干凝胶吸水量为5ml。 Sephadex的化学性质稳定,不溶于水、盐、弱酸和碱, 耐热耐碱不耐酸。 2．稳定性 葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中是稳定的、不溶解的，而且很少产生化学