[工学]ch03 基因工程工具酶.pptVIP

Chapter 03 基因工程工具酶 §3.1 限制性内切酶 §3.2 DNA 聚合酶 §3.3 其他分子克隆工具酶 3.1限制性内切酶(Restriction Endonuclease) 3.1.1 限制与修饰（Restriction and modification）现象 限制：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。 修饰：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。 3.1.2 限制性核酸内切酶的概念 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。 至2006年2月共发现3773种限制性内切酶，I、II、III型各有68、3692、10种，甲基化指导的3种，商品化的609种，II型中共有223种特异性。 3.1.3 限制性核酸内切酶的命名原则 ① 第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名(genus) ② 第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species) ③ 第四个字母代表宿主菌的株或型(strain) ④ 罗马字母表示发现和分离的先后顺序 限制性核酸内切酶的命名原则： 属名 种名 株名 Haemophilus influenzae d 流感嗜血杆菌d株 HindⅡ HindⅢ 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶 3.1.4 限制与修饰系统的种类 Ⅱ 型（type Ⅱ）： 限制酶一般是同源二聚体，修饰酶是单体， 93% Ⅰ 型（type Ⅰ）： 限制酶、甲基化酶识别 DNA 序列的 S 亚基 ， 1% Ⅲ 型（type Ⅲ）：不到 1% 3.1.5 限制酶识别的序列 3.1.5.1 限制酶识别序列的长度及结构 ???限制酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基，最常见的为 6 个碱基 ?4 个碱基识别位点：Sau3AⅠ ?5 个：EcoRⅡ ???NciⅠ ????? 6 个：EcoRⅠ ?????HindⅢ ??7 个：BbvCⅠ ????PpuMⅠ ??8 个：NotⅠ ????SfiⅠ 限制酶识别序列的结构 （1）限制酶识别的序列大多数为回文对称结构 （2）识别序列不是对称的 （3）可识别多种序列 ???? 3.1.5.3 酶切位点 （1）限制酶切割的位置 限制酶对 DNA 的切割位置大多数在内部 （2）位点偏爱（Site preference）????位点偏爱：对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象。 （3）酶切位点在基因组中分布的不均一性 （4） 酶切位点的引入 3.1.6 限制酶产生的末端 （1）限制酶产生匹配粘端（matched ends） （2） 限制酶产生平末端（Blunt end） （3） 限制酶产生非对称突出端 （4） 同裂酶 （5） 同尾酶  3.1.7 酶切反应条件 Tris-HCl 50mmol/L pH7.5 MgCl2 10mmol/L NaCl 0-100mmol/L DTT 1mmol/L Volume 20-100μL Temperature 37℃ Time 1-1.5h ◆1个单位限制性核酸内切酶 3.1.7.1 缓冲液 常规缓冲液一般包括提供稳定 pH 值（7.0-7.9 ）的缓冲剂、 Mg++ 、 DTT（二硫苏糖醇）以及 BSA。 3.1.7.2 反应温度 大多数为 37℃ 3.1.7.3 反应时间??? 反应时间通常为 1 小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶的用量。 3.1.7.4 终止酶切的方法 EDTA 加热 3.1.7.5 影响酶活性的因素 ① DNA样品的纯度 ② DNA样品的甲基化程度 ③ 酶切反应的温度 ④ DNA分子结构（底物构象） ⑤ 核酸内切酶的缓冲液 3.1.8 星星活性（star activity） Ⅱ限制性核酸内切酶的星活性(star activity) 在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列,降低酶切反应的特异性,这种改变的特殊性称为限制性核酸内切酶的星活性。 星星活性产生的原因如下： ① 反应体系中甘油的浓度过高 ② 酶用量过大 ③ 低离子强度 ④ 高pH ⑤ 含有机溶剂 ⑥ 非Mg2+的二价离子的存在。 3.1.9 Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用