重组人色素上皮细胞衍生因子融合蛋白的制备及其抑制新生-生物通.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（１２）：１２～１７ 重组人色素上皮细胞衍生因子融合蛋白的制备 及其抑制新生血管活性的研究 王亚妮　刘先宁　朱娟莉　安　娜　朱秀萍 （陕西省眼科研究所西安市第一医院　西安　７１０００２） 摘要　目的：人色素上皮细胞衍生因子 （ｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍｄｅｒｉｖｅｄｆａｃｔｏｒ，ＰＥＤＦ）是一种有效的新生血 ? 管形成抑制因子和神经营养因子。通过原核细胞表达人ＰＥＤＦ蛋白，鉴定其抑制新生血管的生物学活 性。方法：采用ＰＣＲ法扩增人ＰＥＤＦｃＤＮＡ，将其克隆到ｐＥＴ３２ａ载体中，在大肠杆菌ＢＬ２１中表达人 ＰＥＤＦ蛋白。经ＳＤＳＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定后，镍柱亲和层析法变性条件下纯化重组融合蛋白。 ? Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测蛋白浓度，采用鸡胚脲囊膜法测其对新生血管形成的影响。结果：成功构建了ｐＥＴ３２ａ? ＰＥＤＦ表达载体。重组人ＰＥＤＦ蛋白在ＢＬ２１宿主菌中获得了稳定高效表达，鸡胚脲囊膜实验结果显示 在重组蛋白浓度为０．４、０．０４ｎｇ／ｍｌ时均有对新生血管的显著抑制作用（Ｐ＜０．０１），而在４ｎｇ／ｍｌ时无抑 制作用。结论：成功高效表达及纯化了重组人ＰＥＤＦ蛋白，鉴定其抑制新生血管的生物学活性，并且证 实该活性在一定范围内有效，为进一步研究其功能及推广应用奠定了基础。 关键词　人色素上皮细胞衍生因子　原核表达　新生血管 中图分类号　Ｑ７８ 　　眼部新生血管形成以及与其相伴的渗出、水肿、出 白，是一种有效的新生血管形成抑制因子和神经营养 血、大量炎性细胞浸润以及增生等一系列病理改变可 ［１］ 因子 。 严重破坏眼的结构和功能，导致患者视力障碍。因此， 近年来，通过实验研究发现其具有抗新生血管活 研究新生血管发病机制和能阻止其形成的抑制剂一直 ［２，３］ 性 。由于它能够选择性地抑制异常新生血管，因而 是国内外眼科学领域的热点和难点。眼部新生血管、 成为一种最具前景的新生血管生成抑制因子，逐渐应 特别是眼角膜及眼内新生血管发生的机制其学说众 ［４～６］ 用于眼科和肿瘤等领域 。然而，仅靠从视网膜色素 多，关系最密切的为缺血、缺氧。临床上常见的如各种 上皮细胞培养液中提取ＰＥＤＦ蛋白，来源受限，含量低， 原因的角膜新生血管，糖尿病视网膜病变，年龄相关性 使得这种蛋白的研究和使用受到了限制。本研究成功 黄斑变性，缺血性视网膜病变等以及早产儿视网膜病 构建了ｐＥＴ３２ａＰＥＤＦ原核表达载体，在大肠杆菌ＢＬ２１ ? 变均是目前世界的主要致盲眼病。这些病均是炎症浸 宿主菌中获得了稳定高效表达，并通过镍柱亲和层析 润，血管形成因子的产生，血管形成抑制因子的破坏以 得到了纯化的重组蛋白，鸡胚脲囊膜法鉴定其对新生 及这两种因子之间平衡的失调所致。 血管的影响，为进一步研究其在眼科领域的功能及推 　　人色素上皮细胞衍生因子（ｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ? 广应用奠定了基