载体构建原理载体构建是把连接好的DNA分子运送到受体细胞中.PDFVIP

载体构建 一、原理： 载体构建是把连接好的 DNA 分子运送到受体细胞中去。首先，必须寻找一种能进 入细胞，在装载了外来 DNA 片段后仍能照样复制的运载体。理想的运载体是质粒，在 基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。当给质粒插入一段外源DNA 片段后，它 依然能够继续进行自我复制。将外源基因片段与载体连接 （载体通常选用质粒或者噬菌 体或其他病毒），将重组的载体转染受体细胞，使之整合入宿主基因组或者在稳定存在 于胞质内，是宿主细胞能够表达载体上的外源基因，从而获得新性状或者新产物。 人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐 药性等，质粒载体的最大插入片段约为 10kb。载体改造是分子生物学研究常用的手段 之一。主要包括已有载体多克隆位点 MCS 的改造和已有载体启动子、增强子、筛选标 记等功能元件的改造。载体构建完成后可利用 PCR 原理进行测序验证。 二、加酶切位点引物设计原则： 1、 利用 BioXM 软件分析目的基因所含的，及不含的酶切位点； 2 、 根据所构载体中所含的酶切位点，找到目的基因不含的，上游下游分别选择一个酶 切位点，加在上下游的引物上。正向引物：保护碱基+酶切位点+ （防移码）+正向 序列 （ORF 框，含起始密码子 ATG ） 3、 反向引物：保护碱基+酶切位点+ （防移码）+反向序列 （ORF 框，不含终止子） ※其中：保护碱基：酶切位点所对应的保护碱基，见附录 2 酶切位点：所构载体含有的，而目的基因不含的位点 防移码：防止由于加酶切位点而造成的氨基酸翻译错位 正向、反向序列：直接在引物设计软件上选择 ORF 框两端引物序列 三、实验药品、器材准备： 1、 实验药品：LA Taq 酶 （或高保真酶）、酶切位点 Fast Digest 限制酶、T4 DNA 连接 酶、Nsi I 单酶切酶 （或 Pvu I ）、所构载体空载、LR 重组酶 2 、 器材：PCR 仪、超净工作台等 四、实验步骤： 1、 含有目的基因的菌液及空载菌液转摇 （-80 ℃保存的菌液取 10- 100 μL 加到 20 mL 培养基中），摇过夜。提质粒 （最后一步水加 30μL ） 2 、 质粒稀释，视质粒浓度而定 （300μg/μL 的稀释 500 倍）为 PCR 准备 3、 LA Taq PCR （或高保真 PCR ）加酶切位点： 25μL 体系：10X LA buffer II （Mg2+Free ） 2.5μL MgCl (25mM) 2.5μL 2 dNTP(2.5mM) 4μL 质粒/cDNA 1μL GSP-F 1μL GSP-R 1μL LATaq 0.25μL dd H O 12.75μL 2 程序： 94℃