佐剂制备的情况.PPT

第一单元 综合性实验 实验一 多克隆抗体制备 抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就活化多个B淋巴细胞克隆，所产生多个单克隆抗体（McAb）的混合物，此即为多克隆抗体。 多克隆抗体概念 当抗原刺激机体免疫系统，B细胞在T细胞的辅助下（多数抗原需要T细胞参与），识别抗原的B细胞表位（T细胞识别T细胞表位）后，T细胞和B细胞均活化，由B细胞针对抗原的B细胞表位产生的能与抗原B细胞表位结合并发挥生物学功能的免疫球蛋白。 实验原理 菌种：伤寒沙门菌O901和伤寒沙门菌H901菌株。 动物：体重在2.5kg左右的健康青年新西兰家兔。 培养基：细菌普通肉汤培养基、细菌普通固体培养基。 试剂： 人IgG、羊毛脂、石蜡油、注射用卡介苗、二甲苯、无菌生理盐水、0.5%无菌甲醛盐水、0.5%无菌石灰酸盐水、2 % NaN3和3 %戊巴比妥钠等。 实验器材和材料 器械：细菌接种环、16号钢质注射针头（或7号留置针）、注射器三通阀、5ml无菌玻璃注射器、兔子固定架，灭菌三角烧瓶（200 ml）和烧杯（200 ml）、平皿（直径9 cm）等。 其他：酒精棉、脱脂棉、塑料放血管、纱布、800ml细菌培养用克氏培养瓶，标准麦氏比浊管和50ml圆底进口离心管或100~500ml细菌离心瓶。 仪器：37℃恒温培养箱、37℃恒温气浴（或水浴）摇床、低温高速大容量离心机（水平转子，至少能满足50ml离心管的离心）。 抗颗粒性抗原抗体制备程序 实验方法 免疫时序 第1天 第5天 第10天 第15天 第20天 免疫剂量 0.5ml 1ml 1.5ml 2ml 2.5ml 18~24h后，用无菌生 理盐水菌苔洗下接种 伤寒沙门菌O901、H901 18~24h后，分别用无菌0.5%石灰 酸盐水和甲醛生理盐水洗下菌苔 无菌试验（37℃恒温摇床） 大容量低温高速离 心机离心收集细菌 O901、H901菌液 耳缘静脉注射（1×109/ml ） 耳正中动脉采血 试管凝集试验鉴定 羊毛脂1份 + 石腊油5份 抗可溶性抗原抗体制备程序 弗氏不完全佐剂 弗氏完全佐剂 混合高压灭菌 用人IgG与不完全佐剂按1:1体积比加入，卡介苗的终浓度为1~20 mg/ml。 推成油包水制剂 背部多点注射 免疫时序 第1周 第3周 第4周 第5周 免疫剂量 1ml，200μg 1ml 100μg 1.5ml 150μg 2ml 200μg 最后耳缘静脉 注射加强免疫 耳缘静脉 耳正中动脉 耳缘静脉采血 1 2 3 4 5 6 抗体效价滴定 注意事项 选择合适的动物种属及品系；良好的抗原质量和合适的剂量；合理的修饰；适当的佐剂、免疫强度和免疫途径，有助于提高免疫效果；动物的健康状况等。 实验结果: 观察免疫效果如何？ 分析和讨论： 实验结果或失败的原因，哪些方面还存在问题？ 抗原制备是否达到要求？ 佐剂制备的情况？ 动物状态？ 采血方式？ 江苏大学 邵启祥 实验结果分析和讨论 实验二 单克隆抗体的制备 一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞克隆接受该抗原决定簇所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monclone antibody，McAb）。 单克隆隆抗体概念 实验原理 采用杂交瘤技术将抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合剂融合，杂交瘤既保持B淋巴细胞分泌抗体的能力，又获得了骨髓瘤细胞无限增殖的能力，最后通过筛选获得针对某一抗原决定簇的抗体，此即为McAb。 细胞：SP2/0细胞系、人“O”型红细胞悬液（红细胞反复 洗涤直至不溶血为止，浓度调整至2×107/ml）。 试剂： 50 %（W/V）的聚乙二醇（PEG 1500）、 100×HT母液、100×A母液、琼脂糖、降植烷、二甲基 亚砜、Tris碱、盐酸、硫酸铵液、DEAE-纤维素、 RPMI-1640培养液和新生牛血清。 动物：采用和杂交瘤同源的8周龄的Balb/c健康小鼠，鼠 龄在；另备经产母鼠3~5只。 实验器材和材料 耗材：24孔和96孔细胞培养板、无菌毛细滴管、1ml无菌刻度吸管。 器械：无菌直头和弯头眼科剪各3把、无菌直头和弯头眼科镊3把。 仪器：水平低温冷冻离心机、CO2培养箱。 实验方法 免疫时序 第1周 第3周 第7周 免疫剂量 0.5ml 0.5ml 0.5ml 洗至不溶血 “O”型血 2×107/ml 腹腔注射 离心 眼眶采血 IF鉴定 红细胞免疫 有限稀释克隆化 IF鉴定 再次克隆化 IF鉴定 杂交瘤融合 6