微生的物与基因工程.pptVIP

经过体外基因操作和包装后形成重组 噬菌体，可以通过正常的感染途径进 入宿主细胞； 重组噬菌体DNA也可不经过体外包装 而直接通过转染（转化）方式进入宿 主细胞； 质粒和噬菌体载体都可用于 构建基因文库； 但后者更有优势： 容纳的外源DNA片段较大； 以感染途径进入宿主细胞的 效率比转化高； 三、柯斯质粒载体 柯斯质粒载体 （cosmid vector）， 又称粘粒，是由λ 噬菌体的粘性末端 和质粒构建而成。 Cosmid (cos site-carrying plasmid) 带有粘性末端位点( cos) 的质粒 特点： 1）具有λ噬菌体的特性：在克隆了外源片段后可在体外被包装成 噬菌体颗粒，高效地感染对λ噬菌体敏感的大肠杆菌细胞。进 入寄主的柯斯质粒DNA分子，按照λ噬菌体DNA的方式环化， 但无法按噬菌体的方式生活，更无法形成子代噬菌体颗粒。 2）具有质粒载体的特性：在寄主细胞内如质粒一样进行复制，携 带有抗性基因和克隆位点，并具氯霉素扩增效应。 3）具有高容量的克隆能力：柯斯质粒本身一般只有5～7kb左右， 而它克隆外源DNA片段的极限值竟高达45kb，远远超过质粒载 体及λ噬菌体载体的克隆能力。同时，由于包装限制，柯斯质 粒载体的克隆能力还存在一个最低极限值。例如， 5 kb大小的 柯斯质粒载体，插入的外源片段至少不能小于30 kb。 柯斯质粒用于克隆大片段的DNA分子特别有效，而 这种特性对于研究高等生物的基因组十分重要。 （参见P260） 四、M13噬菌体载体 M13是大肠杆菌丝状噬菌体，其基因组为环状ssDNA， 大小为6407bp 2）进入细胞后，转变成复制型 (RF) dsDNA，然后以滚环方式复 制出ssDNA。每当复制出单位长度正链，即被切出和环化， 并被立即组装成子代噬菌体和以出芽方式（即宿主细胞不被 裂解）被释放至胞外。 1）通过性毛感染雄性（F+或Hfr）大肠杆菌 或通过转染进入雌性大肠杆菌细胞 生活史： M13克隆载体是对野生型M13进 行改造后建成，其特点是虽然克 隆外源DNA的能力较小，一般只 适于克隆300～400bp的外源DNA 片段，但特别适合用于制备克隆 基因的单链DNA。 主要被用于制备测序用单链DNA 模板、特异的单链DNA探针，进 行定位诱变等，也可用于噬菌体 展示（phage display）。 五、噬菌粒载体 丝状噬菌体和质粒载体DNA融合而成，兼有两者优点。 五、噬菌粒载体 六、真核生物的克隆载体 真核生物基因调控以及真核基因产物转录及翻译后的加工 等问题，单用原核生物载体所很难解决 现在常用的真核生物载体，主要有以下二大类： 1）酵母质粒载体 2）真核生物病毒载体 （参见P262） 第九章 微生物与基因工程 是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或 合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内， 使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生 物表现出新的性状。 基因工程（genetic engineering）或 重组DNA技术(recombinant DNA technology) 二十世纪生物科学具有划时代意义的巨大事件，推动了 生物科学的迅猛发展，并带动了生物技术产业的兴起。 微生物在基因工程的兴起和发展过程中起着 不可替代的作用！ “微生物与基因工程” 一、基因工程的基本过程 1. 基因分离： a）分别提取供体DNA和载体DNA 2. 体外重组 b）用专一性很强的限制性核酸内切酶分别切割供体和载体DNA 在DNA连接酶的作用下使具有相同粘性末端的供体DNA片段和 载体连接，成为重组载体。 3. 重组载体的传递与筛选 用人工转化的方法将重组载体导入受体细胞中，并通过一定 的筛选标记筛选得到含有目的外源片段的重组子. 第一节 基因工程概述 4. 在特定的宿主中表达,得到基因工程产品 二、基因工程的发展历史 对基因工程的建立与发展具有重要意义的几项关键技术： DNA的特异切割 DNA的分子克隆（人工转化方法的建立） DNA的快速测序 聚合酶链式反应（PCR）（DNA的体外扩增） DNA合成技术 DNA的定位诱变技术 三、微生物学与基因工程的关系 1）基因工程所用克隆载体主要是用质粒、病毒、噬菌体改造而成； 2）基因工程所用工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的； 3）将外源DNA导入宿主细胞的人工转化方法，是在微生物自然转 化现象的基础上发展起来的； 4）微生物细胞是基因克隆的重要宿主， 5）微生物是基因产物的重要表达载体； 6）基因工程得以建立与发展的理论基础主要