基片的制备点样杂交显色.PDF

第一部分：基片的制备 第二部分：点样 第三部分：杂交 第四部分：显色系统与信号检测 第一部分：基片的制备 基片是生物芯片的基础，是生化反应的载体。生物芯片以其基片的不同可以分为无机基 片和有机合成物基片。前者主要包括玻璃片、塑料、硅胶晶片、微型磁珠，其上的探针主要 以原位聚合的方法合成；后者主要有特定孔径硝酸纤维膜、尼龙膜和凝胶块等，其上的探针 主要是预先合成后通过特殊的微量点样装置或仪器滴加到基片上去 (20­22) 。在选择固相载体 时，应考虑其荧光背景的大小、化学稳定性、结构复杂性、介质对化学修饰作用的反应、介 质表面积及其承载能力以及非特异吸附的程度等因素。 因此制作生物芯片的载体材料必须以 下特征：良好的生物兼容性；足够的稳定性，能够抵抗一定热、酸、碱等条件；表面活性， 表面应具有各种活性基团，以便与各种生物分子连接；良好的光学性质。 基片在使用前一般需活化处理。活化试剂 EDC、NHS 等通过化学反应在载体表面键合 上活性基团如氨基、环氧化物、巯基、醛基、肼基，以便于与配基相结合，形成具有生物特 异性的亲和载体，用于固定生物活性分子，如蛋白质、核酸、多肽等。不同的载体就有不同 的活化方式，玻璃基片常采用氨基、醛基、巯基这三种修饰方式。 主要材料：玻璃片：普通无色玻璃，规格 75×25×1mm  质量要求： 主要设备仪器：通风厨一个、烘箱一台 氨基修饰基片的处理流程：  1）玻片的清洗： 取普通载玻片放入 95%的浓硫酸与 5%重铬酸钾的溶液中浸泡过夜。用蒸馏水洗净玻片， 浸入 25%的氨水中，过夜。取出玻片，超纯水洗净，晾干。  2）玻片的硅烷化： 将清洗后的玻片放入 10mM  氨基丙基三乙氧基硅烷(3­aminopropyltriethoxysilane  APES)  的无水乙醇溶液浸泡 30 分钟。用无水乙醇反复清洗几次，晾干后放入烘箱 （100­110℃） 烘干。 3）氨基表面的活化：  (1)酰化反应：硅烷化的玻片浸于l mmol二异丙基乙胺和1 mmol丙烯酰氯的无水二氯乙烷溶 液中摇晃反应2 h，随后用二氯乙烷清洗，烘干。  (2)氨化反应：1 mmol氨化反应液的配制：0.67 ml的四 乙基五胺、0.65 ml 1.4­对­(3­氨丙氧 基)­丁烷、0.56 m  l 4­氨甲基­1,8­辛二胺、0.66 m  l 4.7.10­三 氧­三二唑啉硫酮二胺、0.52 m  l N,N­  二甲基­1,6­已二胺、0.30 ml 2­(2­氨乙氧基)乙醇、0。02l ml氨基­1,2­丙二醇和0.73 mlJefamine  八种氨基化合物溶解于l00 ml无水的二甲基甲酰胺(DMF)中，将酰化好的玻片置于氨化反应 溶液中过夜，反应时摇晃，然后玻片依次用DMF、甲醇和丙酮清洗，烘干。以上两个反应 可以重复．直至所需的连接分子衍生在玻片表面。  (3)表面活化：将上述氨化液处理的玻片用次亚苯基二异硫氰酸盐溶液（phenylenediisothio  cyanate，PDITC)活化2 h，192 mg PDITC溶于40ml含l0％无水吡啶的DMF中，然后用DMF， 二氯乙烷清洗．干燥。  4）暗盒备用保存 醛基修饰芯片的处理流程：  1）玻片的清洗： 取普通载玻片放入 95%的浓硫酸与 5%重铬酸钾的溶液中浸泡过夜。用蒸馏水洗净玻片， 浸入 25%的氨水中，过夜。取出玻片，超纯水洗净，晾干。  2）玻片的硅烷化： 将清洗后的玻片放入 10mM  氨基丙基三乙氧基硅烷(3­aminopropyltriethoxysilane  APES)  的无水乙醇溶液浸泡 30 分钟。用无水乙醇反复清洗几次，晾干后放入烘箱 （100­110℃） 烘干。  3）玻片的醛基化修饰： 将硅烷化的玻片放入 10mM 对苯二甲醛的丙酮溶液中浸泡 30 分钟。取出，用超纯水清 洗几次、晾干。 注： 此处参考一种醛基修饰的基因芯片基片及其制备方法。 百傲目前使用的此方法。 或：将硅烷化的玻片放入 5%戊二醛的丙酮溶液中浸泡 30 分钟。取出，用超纯水清洗几 次、晾干。  4）暗盒备用保存。 巯基修饰芯片的处理流程  1）玻片的清洗： 取普通载玻片放入 95%的浓硫酸与 5%重铬酸钾的溶液中浸泡过夜。用蒸馏水洗净玻片， 浸入 25%的氨水中，过夜。取出玻片，超纯水洗净，晾干。  2）巯基化修饰： 取