细胞培养技术zuoye.ppt

二．在现代医学和生物科学研究中应用广泛 优点： 1.直接观察活细胞的形态结构和生命活动。用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学 等多种学科研究. 2.直接观察细胞的变化可便于摄影。 3.研究细胞种类如低等到高等到人类、胚胎到成体、正常组织到肿瘤。 4.便于使用各种技术：相差、荧光、电镜、组化、同位素标记等方法观察和研究细胞状况。 5.是分子生物学和基因工程学的研究对象，也是其主要的组成部分。 6.易于施用物理、化学生物的实验研究。 7.易于提供大量生物性状相似的实验对象,耗资少比较经济。 8.成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。 缺点： 组织和细胞离体后独立生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内环境，仍有很大差异。 因而利用培养细胞做实验时，不应视为体内细胞完全相同，把实验结果推测体内，轻易做出与体内等同的结论。 七. 细胞生存环境、条件和代谢 培养细胞生存途径和物质代谢与体内细胞基本相同，随生存环境改变出现一定差异。 （一）环境 培养环境无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件。保证细胞生存环境无任何污染、代谢物及时清除，是维持细胞生存的基本条件。 (二)温度： 人哺乳动物：36.5℃±0.5℃; 鸟类：38.5℃; 一般培养细胞对低温的耐受力比高温强温度上升不超过39℃时,细胞代谢强度与温度成正比。 39～40℃1小时,受损伤的细胞可能恢复； 41～42℃1小时,严重损伤,个别细胞恢复； 43℃以上1小时，细胞全部死亡。 温度不低于0℃时,细胞代谢有影响,无伤害作用; 置于 25～35℃，细胞能生存，但生长速度减慢； 放在 4℃ 数小时,再放回 37℃ 细胞仍继续生长。 细胞代谢随温度降低而缓慢，温度降至冰点以下时,细胞因胞质结冰受损而死亡。 (三)气体环境和氢离子浓度 气体：氧气和二氧化碳 氧气:参与三羧酸循环产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。 氧气分压1995～89975Pa,适用于封闭式单层细胞培养; 开放式培养(碟皿或培养瓶松盖培养)细胞置于95％空气加5％二氧化碳混合气体环境中。 CO2 : 细胞代谢产物,也是细胞所需成分。其主要作用维持培养基的pH值。大多数细胞的适宜pH7.2~7.4，偏离此范围对细胞将产生有害的影响。 有些细胞存在差异。如羊水细胞培养检测染色体时pH为7.6。 细胞耐酸比耐碱性大一些,在偏酸性环境中更 有利于细胞生长。 为了维持培养液恒定的pH，最常用磷酸缓冲剂方法。 磷酸缓冲剂中NaHco3,可供给CO2但容易逸出，适用：封闭式培养的细胞。（无CO2培养箱） Hanks平衡液: 含有低浓度的NaHCO3,当打开含有Hank液培养瓶时，CO2迅速逸出而导致酚红指示剂变红，表明培养液pH变碱，细胞在碱性的环境中时间过长可使细胞碱中毒。 羟乙基哌嗪乙硫磺酸(N`-2-Hydroxyethyl Piperazine-N`-Ethanesulfonic Acid缩写HEPES) HEPES： 对细胞无毒性也不起缓冲作用，主要作用是：防止pH迅速变动，在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持恒定的pH。 （四）细胞生存所需基本物质 与体内基本相同，除碳水化合物、氨基酸、脂类三大类营养物质外，一定量的无机盐、维生素和微量元素等，但需要的量以及代谢方式与体内细胞不尽相同。 糖：六碳糖是主要的能源通过糖酵解 形成 乳酸和通过柠檬酸 形成 CO2。 胚胎细胞和一些转化细胞的培养基中常见到乳酸堆积现象。 糖是合成某些氨基酸的原料； 经过乙酰辅酶A（CoA）合成脂肪； 经过糖解磷酸通路能合成核酸。 各种糖的吸收取决于它们进入细胞的能力,其中葡萄糖最强,半乳糖最低。 2. 氨基酸： 12种氨基酸：精氨酸(Arg)、胱氨酸(Cyst)、异亮氨酸(Zle)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、组氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)是细胞蛋白质合成的原料。 所有细胞都需要谷胺酰胺，其特殊的作用,可促进各种氨基酸进入细胞膜。 所含的 氨 是核酸中嘌呤和嘧啶的来源； 是合成3，2