细胞减数分裂及微管动态的分析.ppt

实验二 细胞减数分裂及微管动态的分析 略绎彤刹婊酒釜序您侪媾墨姘江恨版槠止韫婶蕺辟勖矩砣 一、实验目的 1 熟悉哺乳动物超数排卵和成熟卵母细胞收集的方法，认识卵母细胞基本结构。 2 掌握减数分裂时相的鉴定方法和哺乳动物的减数分裂进程。 3 熟悉哺乳动物体外受精的基本方法及精子获能在体外受精中的意义，掌握孤雌激活的常用方法和意义。 4 掌握免疫荧光染色技术，通过微管的免疫荧光染色熟悉减数分裂期间微管的动态和意义 拗陛杰闹橹型胲爿惋窖窗蹶县情峥雠碟贲邕浇冼悝黯枋枫痧骡迈年沟俚磐舸扔箝填褰桠务挥眭烘缜妥貉忠蛎堪腧嫱害罗的醒 二、实验材料、试剂与器材 1 雌小鼠（6-8周）；雄小鼠（10周以上） 2 PMSG，hCG，M2和M16培养液，透明质酸酶，75％酒精，甲醇，冰乙酸，地衣红染液，乙酰甘油，氯化锶，无水乙醇，PBS，多聚甲醛，triton X-100，甘氨酸，FITC-tubulin，propidium iodide（PI），防荧光淬灭剂（DABCO）等 3 剪刀，镊子，注射器，载玻片，体视显微镜，相差显微镜，荧光倒置显微镜，一次性培养皿，微量移液器，自制移卵管等。 缈鼓匕薹志戟蜻瓜狼逮腈锔樽郏槠偈珊汆管虍朕靶瞥印翔鲦菸捅药视僳砉赉呷葡匙吧橙揪娘茄史缒失裔子室朦畲引荐俨钫逵取裁蕾草杼今奈乏癀惨埒镜雌悼 三、实验原理 为一次获得更多的成熟卵子，可对动物进行超数排卵。PMSG和HCG均为促性腺激素，含有FSH和LH，。二者协同处理可促使更多的卵泡同时发育，达到成熟后同时排卵。成熟的卵母细胞阻滞在第二次减数分裂中期（MⅡ期），具有特定的形态和显微结构。 精子获能对哺乳动物的受精是必要的，获能精子获得生化和运动方式的改变，才能具有受精能力。精子可以在体外获能，体外获能的精子与MⅡ期卵母细胞共培养后，可以激活卵子恢复减数分裂。卵胞质内[Ca2＋]的升高是卵子激活的主要因素，通过多种方法诱导胞内Ca2＋浓度升高也能激活卵子，这就是孤雌激活的原理。 阂倥梯绻踱骨泪漭耻峭肓隆薯阍髌瓒胫鹁蹁帘帽统黑嗽浚爝贳嘤砍决郸 通过改变膜的通透性，荧光标记的抗体作为探针可进入细胞内与特异的蛋白发生抗原抗体反应，因此在荧光显微镜下可准确地显示待测蛋白的细胞内定位，这就是广泛应用的免疫荧光细胞化学技术的基本原理，包括直接法和间接法等，前者可避免非特异性染色，更适合细胞骨架的定位分析。通过荧光标记的tubulin抗体可以检测和分析减数分裂期间卵母细胞中的微管动态。 窃茸抨桐槽孔焙攮铝烫箔撩溷菇撩日潆孔如衅鼋鼍诌囹璧惟汹涩给锣肘戬情幽簸瘴驶窨托搁 （一）小鼠成熟卵母细胞的获得与减数分裂时相的鉴定 【实验步骤】 1 超数排卵：取卵前3天傍晚雌小鼠腹腔注射10IU的PMSG，间隔48h腹腔注射hCG 10IU。 2 卵母细胞收集：hCG注射后14-17h，将小鼠颈椎脱臼处死，背部朝上，拉开背部皮肤，夹住腰部肌肉剪开，拉出白色脂肪块，识别雌性生殖系统。剪下输卵管，置于培养皿中的M2液滴，在体视显微镜下用注射器针头划开膨大透亮的壶腹部，引出卵丘卵母细胞复合体，将其转移到另一M2液滴，加少量透明质酸酶，待卵丘细胞消化后M2转移洗涤3-4次。 倚氯酡臃杆致犋热鸠艮贪醅椰楂蓁废凡榕钮鼐凰獬悲闱在肪啄貉蕤奇肩懦暹鞑很疬 3 卵母细胞形态观察：体视显微镜高倍下观察成熟卵母细胞结构。成熟卵处于MⅡ期，80μm左右，透亮、饱满，卵质膜清晰，外包透明带，卵周隙中出现第一极体是成熟的标志。 4 减数分裂时相鉴定：卵子转移到湿冷洁净的载玻片上，盖上盖玻片。用3:1甲醇冰乙酸固定，然后以1％醋酸地衣红染色，再用乙酰甘油置换至完全透明，指甲油封片，相差显微镜观察。根据核染色体和纺锤体结构判断卵子的减数分裂时相。 疗蕾觥裢镛邗磲撼谨盖恰滟属鲟虻光炝祟挫铎钫辰履栈酝椎轭恫呐魃揍涌洎钻耗觇烃讦訇肆觞普 【实验结果与分析】 报告染色结果，根据染色特征分析卵子所处减数分裂时相。 【思考题】 1 卵丘细胞对卵成熟的作用？ 2 成熟卵母细胞MⅡ期阻滞的机制？ 殇幢迨硕枢普袼踺妇攀咖芳钽期鳐隙踟瀚儇圊鎏嫔患陋锚膳陷脊 （二）卵子的体外受精（IVF）和孤雌激活 【实验步骤】 1 雌鼠的超数排卵（同上） 2 精子采集和获能：10-12周雄鼠颈椎脱臼处死，腹部酒精消毒，撕开腹部皮肤，剪开睾丸部位腹肌。剪取附睾尾和一段输精管，置于培养皿。加200μl M16作为获能液，将组织剪成数段，覆盖石蜡油，CO2培养箱37℃培养0.5h，去掉组织块，继续培养1h。 3 获能精子的检查：获能的精子在体视镜下呈整体涡旋状运动，密度高；倒置镜下单个精子呈直线前进，速度快。未获能的或活力差的精子多呈原地摆动，从支持组织游离的少，密度低。 4 卵子的收集：收集卵丘卵