基因编辑方法CRISPR-Cas9PPT.pptx

CRISPR-Cas9一种新型基因编辑方法基因组编辑技术 又称基因组定点修饰技术，通过在某些物种基因组中进行靶向特异性的突变，从而解答并提出更多精确的生物学问题。方法包括：锌指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFN）技术转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技术 Cas9/gRNA 系统(CRISPR-cas9技术)锌指核酸酶（ZFN）＆转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）技术Cell 2014 157,1262-1278 Figure2B 不论是TALEN技术还是ZFN技术，其定向打靶都依赖于DNA序列特异性结合蛋白模块的合成,将蛋白模块与限制性内切酶 (FokⅠ) 的DNA切割域融合而得到。由蛋白特异结合域定位，DNA切割域剪切。Cell 2014 157,1262-1278 Figure2A CRISPR-Cas9 技术原理：规律性重复短回文序列簇（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs）CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌在不断进化的过程中获得一种适应性免疫防御机制，研究者根据 CRISPR-Cas 系统的特性对此系统进行改造产生了第 3 代人工核酸内切酶技术——CRISPR-Cas9技术。该技术通过小片段的 RNA 介导对入侵的核酸进行靶向定位并通过Cas酶对核酸进行酶切、 降解。 CRISPR-Cas9 技术是一种多物种适应性的，位点特异性的有效基因组编码工具。Cell 2014 157,1262-1278 Figure4 CRISPR-Cas9 技术sgRNA 的设计选择 PAM（NGG）5‘端的一段碱基序列20nt作为原间隔序列，即敲除的靶位点。(PAM，Protospacer adjacent motifs 原间隔序列临近基序。一般形式为 NGG，其作用是将间隔序列定位于入侵的噬菌体或质粒的 DNA 序列中)原则： 选择的序列必须在全基因组中进行比对，原间隔序列必须唯一，否则会对其他基因进行敲除而出现错误的实验结果。优先选择 DSB 位点的侧翼存在重复序列（如果 DSB 的侧翼存在重复序列，在进行非同源末端重组时能够精确的介导断裂位点碱基的缺失）。PAM 的5‘端尽量存在酶切位点。（有利于后期的活性检测）gRNA的活性检测限制性内切酶法 当 Cas9/sgRNA靶点位置中间序列存在限制性内切酶切位点时，如果通过 Cas9/sgRNA 发生突变，这个位点将可能被破坏，而不能被 内切酶酶切。可采用电泳的方法估计突变效率， 以突变效率的高低来衡量sgRNA 的活性。非配对内切酶法 T7 核 酸 内 切 酶 I（T7 endonuclease I，T7E1） 能够识别不完全配对 DNA 并对其进行切割，如果通过 Cas9/sgRNA 发生突变，将基因组DNA 做 PCR，将相对应的 PCR 产物与野生型 DNA的 PCR 产物等量混合，并退火杂交，将产生非配对DNA 片段，将能被非配对内切酶 T7E1 剪切。用电泳的方法估计突变效率，以突变效率的高低来衡量 sgRNA 的活性。SSA 活性检测 一个终止子插入 luciferase（GFP）的编码区中央，luciferase（GFP）就会失去活性。为检测 Cas9/sgRNA 剪切活性，将一个 Cas9/sgRNA的靶点位置序列插在终止子后。在Cas9/ sgRNA 的作用下，靶点位置产生 DSB，细胞通过同源重组方式修复 DNA，形成一个有活性的luciferase。通过与对照组的比值变化就可反应 Cas9/sgRNA 剪切的活性水平。降低sgRNA/Cas9脱靶率的方法Cell 2014 157,1262-1278 Figure6A,B Cas9的两个内切酶活性域为RuvC和HNH,两个亚基分别负责对一条DNA单链的切割。任一亚基的失活都将形成DNA单链断裂（nicked DNA）。 当结合于两条互补的 DNA 链上相邻位置的一对 sgRNA 同 时引 导Cas9 D10A 识别并切割靶位点时才能造成 DSB，从而加大了识别的长度，有效的提高了 Cas9-sgRNA 技术的特异性。重组质粒导入细胞/生物体Cell 2014 157,1262-1278 Figure6C,D,EC、将编码Cas9和sgRNA的表达质粒直接转染至细胞系中。D、将纯化的Cas9和体外表达的sgRNA显微注射至受精卵，快速得到转基因动物模型。E、将编码CRISPR组分的高效价的病毒载体转导至组织或细胞，完成特定时间，组织的基因编辑。CRISPR-Cas9