第9章 酶免疫试验PPT.ppt

* * * * * * * * * * * * * * 酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底物的作用进一步提高敏感性。 均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原的测定，异相酶免疫测定根据是否使用固相支持物，又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。 小 结 标记酶的要求： 1.纯度高,活性强,催化反应效率高。 2.易与抗体或抗原结合标记后酶活性稳定，不影响抗原抗体反应性。 3.作用专一，且酶活性不受样品其他成分影响。 标记酶的要求： 4.酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法敏感，重复性好，简单易行。 5.酶、辅助因子及其底物对人体和环境无害，易于配制、保存，价廉易得。 辣根过氧化物酶（HRP） 糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心 RZ值：403nm （辅基）与275nm（主酶） OD值之比 RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要 ELISA中应用最为广泛的标记用酶 常用酶 酶和酶作用底物 碱性磷酸酶（AP） 菌源性AP 肠黏膜AP β–半乳糖苷酶（β-Gal） 用于均相酶 免疫测定 常用酶 酶和酶作用底物 HRP的底物 DH2+H2O2→ → → D+2H2O HRP 供氢体DH2习惯上被称为底物， 底物有多种 H2O2为受氢体， HRP对受氢体的专一性很高 常用底物 酶和酶作用底物 HRP的常见底物 邻苯二胺 (OPD) 四甲基联苯胺 TMB 5-氨基水杨酸 (5-ASA ) 2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 (ABTS) 常用底物 酶和酶作用底物 OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。 TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。 　HRP的常见底物 酶和酶作用底物 ALP底物 β-Gal 的底物 对-硝基苯磷酸酯（ pNPP ） 4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（ 4MUG ） 经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。 酶作用后，生成高强度荧光物 ，用荧光计 测量。 常用底物 酶和酶作用底物 酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物（conjugate） 酶标记物 通过化学反应让酶与 抗体或抗原形成的 结合物 二、酶标记抗体或抗原 抗原要求纯度高，抗原性完整 抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。 制备方法要求 (一）酶标记抗体或抗原的制备 制备方法要求 技术方法简单、产率高，重复性好 标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性 酶标记物稳定，不形成聚合物 (一）酶标记抗体或抗原的制备 标记方法 1 改良过碘酸钠法（直接法） 常用于HRP标记抗体或抗原 2 戊二醛交联法 第一节 酶标记抗体或抗原制备 戊二醛交联法 戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。 第一节 酶标记抗体或抗原制备 纯化 及 鉴定 常用的纯化方法： 1.葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化 2.50%饱和硫酸铵沉淀提纯 （二）酶标记物的纯化及鉴定 * * * * * * * * * * * * * * * * * 二、ELISA方法建立的基本步骤 （一）ELISA方法类型的建立 1 初步确定方法类型 2.工作条件的优化 3.ELISA检测结果测定 （二）对建立的方法进行评价 固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物） 酶反应的底物 三个必要试剂 三、方法类型及反应原理 双抗体夹心法 方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色 应用： 二价或二价以上的较大分子抗原 测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等 ELISA检测抗原的方法 1、已知抗体包 被于载体表面 3、加酶标抗体 与抗原结合 4、加酶作用的底物 产生颜色 2、加待检物 抗原与抗体结合 4、加酶作用的底物 不产生颜色 双抗体夹心法测抗原 1、已知抗体包 被于载体表面 2、加待检物无抗 原与抗体结合 3、加酶标抗体 无抗原结合 E E E E E E E E E + - 竞争法方法：用已知抗体包被，同时加入待测血清和酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等） ELISA检测抗原的方法 竞争法测抗原 + - E