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国家加工食品质量监督检验中心（福州） 一、色谱法概述 二、液相色谱仪操作和维护技巧 液相色谱仪 液相色谱仪 1. 结构流程 主要部件 (2) 梯度淋洗装置 (3) 进样装置 (4) 高效分离柱 (5) 检测器 检测器 b. 光电二极管阵列检测器 光电二极管阵列检测器 三维：光谱-色谱图 c. 示差折光检测器（Differential refractive index detector） d. 荧光检测器（Fluorescence detector） （2）用体积表示的保留值 分配系数 K 的讨论 液相色谱分类 液-固吸附色谱 液-液分配色谱 离子交换色谱 离子对色谱 排阻色谱 亲和色谱 4.4.2 液-液分配色谱 4.4.3 离子交换色谱 4.4.5 离子对色谱 ion pair chromatography 基本原理： 4.4.6 排阻色谱size- exclusion chromatography 4.4.7 亲和色谱(AC)　Affinity chromatograph 1.液-固吸附分离固定相 （3）化学键合固定相 化学键合固定相的特点： 3.离子交换色谱分离固定相 4. 空间排阻分离固定相 液相色谱的流动相 2. 流动相类别 3. 流动相选择 4. 选择流动相时应注意的几个问题 分离类型选择 按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时，首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷 (最小) （1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积，损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失，酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。 （4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有强紫外吸收。 色谱理论需要解决的问题？ 色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。 组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？ 组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制； （组分和固定液的结构和性质） 色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制； （两相中的运动阻力，扩散） 两种色谱理论：塔板理论和速率理论。 塔板理论的假设： (1) 每一个平衡过程间 隔 内，平衡可以迅速达到； (2) 将载气看作成脉动（间歇）过程； (3) 试样沿色谱柱方向的扩散可忽略； (4) 每次分配的分配系数相同。 3.2.2 塔板理论-柱分离效能指标 1.塔板理论（plate theory） 半经验理论；将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复。 色谱柱长：L， 虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为 保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配! 理论塔板数与色谱参数之间的关系为 n = L / H 色谱峰的方差? 与柱长或保留时间的关系为： 2.有效塔板数和有效塔板高度 单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。 用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。 组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度： 3.塔板理论的特点和不足 (1)当L一定时，n 越大(H 越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。 (2)不同物质在同一色谱柱上的 K 不同，用n有效和H有效作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。 (3)柱效的高低不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。