fbn__基因工程的基本技术2.ppt

基因工程的基本技术之二 主要内容 ?定义：指能识别特定的DNA序列并在一定的条件下可在识别位置或附近对DNA 进行切割的酶。 ?限制性内切酶的种类 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 限制性活性 + + + 甲基化酶活性 + - + DNA识别序列 + + + 切割特异性 随机 专一 切割位点距识别 位点10-25bP 对ATP依赖性 + - + 对Mg2+依赖性 + + + 蛋白质结构 3种不同亚基 单一成分 2种不同的亚基 2）、产生3‘粘性末末端：如PstI ② 产生平末端： 星活性（star activity）: 在非最适合的条件下酶的识别特异性降低，产生非特异性带，这种活性称星活性。 用时在冰上操作； 取酶用干燥、灭菌、新的枪头 酶用量不能超过酶切总体积的10%； 多种酶进行酶切时，先低盐后高盐缓冲液； ? 效率：粘性末端平端(100倍)； ? 5，突出3，突出； ?平端：HaeIIIAluIHinCIISmaI ? ATP：反复冻熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，连接缓冲液宜分装； ?单价离子：150-200mM NaCl，提高连接效果； ? PEG：5%以下可以提高连接效率 ? 依赖DNA的聚合酶： DNA聚合酶 I ? 依赖RNA的DNA聚合酶：逆转录酶 ? 不依赖DNA的聚合酶：末端转移酶 ? 基本性质： ? 5‘→3‘的DNA聚合酶活性； ? 5‘→3‘的核酸外切酶活性； ? 3‘→5‘的核酸外切酶活性。 ? Klenow酶的来源： —大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶。 ? Klenow酶的基本性质： ? 5‘→3‘的DNA聚合酶活性 ? 3‘→5‘的核酸外切酶活性 ?依赖于RNA的DNA聚合酶,最主要用途，以mRNA为模板合成cDNA 载体的功能： 运送外源基因高效转入受体细胞； 为外源基因提供复制能力或整合能力； 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。 ? 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）； ? 具有合适的筛选标记； ? 具有较高的外源DNA的载装能力； ? 具有多克隆位点（MCS）； ? 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 一、质粒 质粒的基本特征： （1）质粒的自主复制性质 ——质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。 ? 严紧型：1 - 3 拷贝 ? 松弛型：10 - 60 拷贝 （2）质粒的不相容性 ● 定义： 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。 ● 分子机理： 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制同时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。 （3）质粒的可转移性，如F、Col、R质粒等 （4）携带特殊的遗传标记： ?物质抗性：如抗生素、重金属离子 ?物质合成：如细菌毒素、有机碱 1、?噬菌体载体 属温和型噬菌体； 具有COS黏性末端； 类型分为：替换型和插入型； ?替换型载体-可插入12-25KB的片段 ?插入型载体-可克隆小于10KB的片段 2、柯斯质粒 (Cosmid ） 是一种带有黏性末端位点的质粒 构建：是一种以?噬菌体为基础为克隆大片段而设计并和质粒共同构建的杂合载体，具有噬菌体的COS位点和质粒的复制子，具有噬菌体和质粒的双重特征。 三、人工染色体载体 类型 BAC： bacterial artificial chromosomes ，细菌人工染色体 YAC： yeast artificial chromosome，酵母人