chapter 3 基因分离与鉴定之DNA插入.ppt

如果此段DNA插入序列是已知的，则可利用已知DNA序列获得旁邻序列，最终确定导致表型变化的目的基因。 由于插入的DNA序列相当于人为地给目的基因加上一个序列标签，因此用此DNA插入突变分离基因的技术又称为DNA标签法 （DNA tagging). 插入突变在功能基因研究中已成为一种非常诱人的方法，因为已发展了若干种成熟的方法来分离插入二侧的基因组序列，建立侧翼序列库。 转座子是基因组中一段可移动的DNA序列，可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。 常用植物转座子标签的转座子 名 称 来 源 类 型 Ac(Activator) 玉米 Ⅰ类自主型转座子 Ds(Dissociation) 玉米 Ⅰ类非自主型转座子 Mu(Mutator) 玉米 Ⅰ类自主型转座子 Spm/En 玉米 Ⅰ类自主型转座子 Tam 金鱼草 Ⅰ类自主型转座子 dTphl 拟南芥 Ⅰ类自主型转座子 Tos17 水稻 Ⅱ类反转录转座子 原理： 化学诱变剂处理的另外好处是突变的频率高、不需组织培养等过程。 方法一般有EMS诱变、MNU诱变等； 这一方法中最关键的问题是必须能灵敏检测出点突变。 总结 基因分离 图位克隆法 基因标签法（转座子标签、T-DNA标签、激活子标签） 同源克隆法 功能鉴定 功能互补、RNA干扰、过表达、基因突变 应用举例 重组人胰岛素的生产。 早期的胰岛素主要来源于猪胰岛素化学转化为人胰岛素，但是存在免疫原性、生产工艺复杂、成本高等诸多缺点。 1982年，Eli Lilly公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，其后Novo公司又开发了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。 这种基因工程产物在降低血糖等生物活性方面与天然胰岛素一致，并且有不含免疫原性和注射吸收快的特点。 具体步骤： 练习题 1、简述基因工程的基本过程。 2、PCR技术的基本原理？ 3、基因工程中常用的酶有哪些，各自的作用特点是什么？ 4、基因克隆的载体有哪些基本特征？ 5、例举两种筛选阳性克隆的方法及原理？ 6、分离目的基因有哪几种主要方式？请详细阐述一种的基本原理？ 7、基因功能鉴定的方法有哪些？结合你的理解加以说明 8、结合你所学的知识，谈谈你对转基因食品的安全性的理解。 基因分离的途径： 2、筛选cDNA （complementary DNA）文库 由mRNA反转录而成 分离编码蛋白质的基因的相应cDNA。 1、筛选基因组DNA文库 分离基因完整的调控序列、编码区和非编码区序列。 3、依赖于PCR技术 包括基因组扩增和反转录cDNA的扩增。 功能鉴定的方法 转基因介导的功能互补法: 互补测试（Complementation test) 基因敲出（knockout）或敲下（knockdown） 基因过量表达（overexpression） 基因突变： 自然或人工（理化）突变 T-DNA插入、转座子插入 互补测试 RNA干扰（RNA Interference） RNA干扰是通过双链RNA的介导特异性 地降解相同序列的mRNA 来抑制基因的 表达，它是一种转录后基因沉默机制, 为 反向遗传学研究功能基因开辟了一条新 路。 RNA干扰研究功能基因的特点： 1 ）RNA 干扰具有很高的特异性，能够非常特异地只降解与之相应的单个内源基因的mRNA； 2 ）RNA 干扰抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体的程度，少量的双链RNA分子就能够完成抑制相应基因的表达； 3 ）RNA 干扰抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持。 基因过量表达 Over expession 有时候： 过犹不及，机体的反馈抑制 产生新功能 TILLING（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes） 这是一种高效的用反向遗传学的方法来研究功能基因，它可以大范围筛选通过化学方法诱导的突变体，适用于拟南芥菜和其他各种植物。 上面我们介绍的基因失活是外源DNA插入后引起，所以易导致致死突变。TILLING中用化学诱变剂处理只引起点突变，产生一种传统意义