生物显微技术3- 细胞化学和组织化学PPT.ppt

五、色素染色法 色素分为人为色素和自生性色素。人为色素是由于固定剂与组织中某些成分相作用而产生。例如福尔马林色素，这种色素在切片染色前可以酒精苦味酸或氢氧化钠水溶液处理除去；而含有升汞固定液所产生的汞色素则可用碘处理除去，含铬酸盐固定而产生的黄色沉着物则可用酸酒精处理除去。 在某些病理情况下，细胞代谢所产生和沉着的色素，如脂褐素、黑色素、含铁血黄素、嗜铬、嗜银颗粒及组织内的微量金属离子等，则需要一些特殊染色加以证明。 如：黑色素染色法： 黑色素是深褐至黑色的颗粒状色素，常见于皮肤色素细胞，恶性黑色素瘤。组织内大量存在时呈棕黑色，易于鉴别。但量少时则需用特殊染色来显示鉴别。 黑色素不能为有机溶剂溶解，但易于用强氧化剂漂白而脱色。另外，黑色素本身具有还原银液的能力。因此，用氨银可以将组织中的黑色素显示黑色。通过铁反应也可将其呈暗蓝色而显示出来。 Fontana氏染色法： 5%硝酸银水溶液染色 以0.2%氯化金水溶液增色 结果：黑色素呈黑色。 六、酶类 显示酶的组织化学方法与其他组织化学方法不同，大都分组织化学方法是染色剂和组织成分的反应， 反应物直接来自于组织成分，如DNA、RNA、糖原等。 而存在于组织细胞内的各种酶，是通过一种间接的方法，显示的是其活性，看不到酶本身。这种方法是在一定条件下，将组织细胞中的酶作用于特定的底物，以底物分解产物作为反应物质，再在原作用部位进行捕捉反应物质而显色，所以我们看到的颜色实际上只是底物的颜色。 在显示酶的组织化学方法中，因显示的是酶的活性，所以最大限度地保存组织中酶的活性是非常重要的。 所选择的方法既要保存好组织细胞的形态结构，以保证酶在组织细胞中的准确定位，又要保证酶不失活或丢失。 影响因素:影响显示酶的因素很多，归纳起来大致有以下几种： （1）温度：在酶反应时。需要有一定的温度。多数酶最适宜的反应温度是20~37℃，过高的温度会使酶蛋白变性、失活，酶的反应速度增快；温度过低酶反应速度减慢，只适应于酶活性强的组织。不过反应温度低时。酶定位较好，不容易扩散。 （2）pH：各种酶都有各自最佳的反应pH值，在适宜的pH值内，酶的活性最强，反应速度最大，强酸、强碱都会便酶失活。 （3）抑制剂和激活剂：能使酶活性降低的物质为抑制剂，如某些金属离子或氧化还原剂。能使酶活性增强的物质为激活剂，如另一些金属离子或其他基团等。 （4）反应底物的浓度：恒定的底物浓度也很重要，过高或者过低都会影响酶组织化学的反应速度。 常用的组织化学方法 （1）金属沉淀反应法：特定的有色的金属盐与酶的分解产物结合、置换，通过金属显色来间接证明酶的存在。 （2）偶联偶氮法：萘酚系列化合物的底物在酶的作用下，产生分解产物，与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应，形成不溶性偶氮色素，显示酶的定位。这些底物多为人工合成。根据抑制酶的强弱可以分为同时偶联法、后偶联法。偶氮偶联法目前被运用较广。 （3）色素形成法：底物的无色化学物质在酶作用下，在作用局部形成色素沉着，而显示酶的位置，如四唑盐法、靛酚蓝法、黑色素形成法、靛蓝形成法、白色色素法等。 （一）显示碱性磷酸酶的 Gomori改良钙-钴法 碱性磷酸酶（AKP）是组织化学最常研究的酶之一，分布广泛，常见于转运功能活跃的细胞膜上，又称为膜酶。此酶在小动脉和毛细血管内皮、肝毛细胆管膜、肾近曲小管刷状缘、肠上皮纹状缘等处最为丰富，再生组织细胞之内也有。 碱性磷酸酶在碱性环境下催化水解磷酸单脂生成磷酸和醇，属于水解酶。激活剂有Mg2＋、Mn2＋及某些氨基酸等，最适pH为9.2-9.4。抑制剂有砷酸盐、碘液、氰化物。 本方法选用Mg2＋离子为激活剂，在pH 9.2-9.4孵育时，底物β-甘油磷酸钠被水解为甘油和磷酸，磷酸立即为高浓度的钙盐所捕获，磷酸与Ca2＋结合而形成磷酸钙沉淀于酶活性部位，再经硝酸钴转变成不溶的磷酸钴，经硫化氨处理后，磷酸钴又变成黑色不溶的硫化钴沉淀，而显示碱性磷酸酶的活性部位。 （二）显示酸性磷酸酶的萘酚 AS-BI法 酸性磷酸酶（ACP）在酸性环境下，催化水解磷酸单脂生成磷酸和醇，又称为酸性磷酸单脂酶。酸性磷酸酶分布广泛，在前列腺、肝、脾酸性磷酸酶最为丰富。前列腺含量最高，其次吞噬细胞含量也丰富。肝内毛细胆管旁、Kupffer细胞内、肾小管细胞内、空肠上皮刷状缘、肾上腺都有酸性磷酸酶，主要位于溶酶体，又称溶酶体酶。在组织退变、核酸和蛋白质代谢活动增加时，酸性磷酸酶的活性均增加。它还参与脂类代谢、神经传导冲动等。 第三章 细胞化学和组织化学 细胞化学和组织化学(cytochemistry and histochemistry)技术是以细胞学、组织学为基础，运用物理的和化学的方法来显示细胞组织结构中各种化学物质(如无机物、脂类、蛋白质、维生素、核酸、酶等)的定性、定位、