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电泳技术 1 电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷相反的电极移动的过程。 2 电泳技术优点：快速、准确、重现性好 3 电泳方法分类 按电场分：常压（500V，适用大分子）、高压（500V，适用小分子） 支持体分：自由电泳、区带电泳 仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式 4 电泳条件：水溶液（缓冲液）、支持物（区带电泳）、电场（电泳仪、电泳槽） 一 电泳的基本原理 电泳分离： 移动方向：带电性质决定 泳动度：带电颗粒在单位电场强度下的移动速度。 μ ＝v/E=(d/t)/(V/l)=(dl)/Vt 影响μ的因素： 1颗粒本身：带电、大小、形状 2 外界因素：电场强度E、pH、离子强度I、电渗、缓冲液粘度及温度等。 二 电泳的分类 分为自由电泳（无支持体）和区带电泳（有支持体）两大类。 自由电泳包括Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。 区带电泳包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。 三 纸电泳 以滤纸为支持体的电泳技术 操作要点： 1 选择缓冲液 对显色剂和紫外光吸收等观察区带的方法无影响 2 滤纸的选择与处理 层析用滤纸，纸宽2～3cm/样品组分，长短影响电场强度。 3 点样 点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知样品）、点一边（已知样品） 干法、湿法 4 电泳 电桥水平、加盖、电压稳定、注意时间 5 显色及分析 蛋白：溴酚兰、氨黑10B、偶氮胭脂红B Aa：茚三酮、靛红 核酸：紫外光下观察 一般洗脱定量 四 薄膜电泳 支持体：薄膜 优点：分辨力较高、简便、快速、区带清晰、易于定量、便于保存 广泛应用于蛋白质和同工酶等的分离分析 操作 1 薄膜的处理与放置 2 点样 平衡 3 电泳：E 10~25V/cm，0.5～2h 4 显色 五 薄层电泳 将支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄层进行电泳。 常用支持物：淀粉、琼脂、纤维素粉、硅胶等 操作： 1 缓冲液选择 离子强度较高的缓冲液 2 支持物处理 精制品 3 薄层板制作 4加样：挖沟、混合样品、填埋 5 电泳 6分析：印染法 六 凝胶电泳 支持物：多孔凝胶 聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等 具有电泳和分子筛的双重作用，分辨力高 最常用聚丙烯酰胺凝胶，原因： 机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。 分类：垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳； 连续、不连续、梯度、SDS凝胶电泳 凝胶电泳的操作要点 1 凝胶制备 2 电极缓冲液 3 样品处理及加样 4 电泳 5 染色与固定 6 脱色 7 分析 七 等电点聚焦电泳 电泳系统中加进两性电解质载体，当通已直流电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。P进入时，不同的P移动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的P得以分离。 优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定P或多肽的等电点。 缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的P。 1 稳定的pH梯度的形成 2 两性电解质载体 要求： 由多乙烯多胺与丙烯酸加成制备（有不同pH范围的商品两性电解质载体） 3 支持pH梯度的介质 密度梯度溶液（用于自由电泳） 凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶） 4 操作要点 pH梯度支持介质的制备 聚焦电泳 检测 两性电解质载体的除去 电泳技术思考题 1名词解释 电泳、电泳分离技术、泳动度、电渗、区带电泳、相对迁移率 2 影响泳动度的主要因素有哪些？ 3 区带电泳的操作步骤一般有哪些？ * * 烟曲霉菌中抗真菌活性肽类物质的分离与纯化 * * *