核酸生产幻灯片演示稿.ppt

项目二、核酸生产任务1、核酸制备方案生物制药1111樊贝贝 目录 核酸知识复习 核酸类药物特性 动物肝脏DNA的提取 酵母RNA的提取 核酸类药物检测 核酸知识复习 　　　 核糖（核糖　脱氧核糖） 　　　　　　　　　　　　核苷　　　　　 嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤） 　　　　　　　　　　　　　　　　碱基 核酸　　 　 核苷酸　　　　　　　　　 嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶） （DNA、RNA） 　　　　　　　　　　　　磷酸 DNA和RNA是存在于细胞中的正常成分。 DNA主要存在于细胞核中，少量（2%）存在于线粒体和叶绿体中； RNA主要存在于细胞质中，少量（10%）存在于核仁、核浆和染色体中。 核酸的含量与细胞大小无关，以生长旺盛的组织细胞中含量较多，如动物胰脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。 核酸类药物特性 又称核苷酸类药物。由某些动物、微生物的细胞中提取出的核酸(包括核苷酸和脱氧核苷酸)，或者用人工合成法制备的具有核酸结构(包括核苷酸和脱氧核苷酸结构)同时又具有一定药理作用的物质，称为核酸药物或核酸类生化药物。广义的核酸药物可包括核苷酸药物、核苷药物及含有不同碱基化合物的药物。核酸药物具有多种药理作用， 按其作用特点可分为： (1)抗病毒剂，代表药物有三氮唑核苷、无环鸟苷和6可糖腺苷等，临床上用于抗肝炎病毒、疱疹病毒及其他病毒； (2)抗肿瘤剂，代表药物有用于治疗消化道癌的氟尿嘧啶以及用于治疗各类急性白血病的阿糖胞苷 (3)干扰素诱导剂，代表药物为聚肌胞，临床上用于抗肝炎病毒、疱疹病毒等； (4)免疫增强剂，主要用于抗病毒及抗肿瘤的辅助治疗； (5)供能剂，用于肝炎、心脏病等多种疾病的辅助治疗。药用腺苷三磷酸(ATP)原粉可从酵母RNA为原料制备，也可通过人工合成及发酵生产。 核酸类药物 动物肝脏DNA的提取 目的： 了解分离提取DNA的一般原理，掌握从动物肝脏中提取DNA的方法 原理 在浓氯化钠（1-2mol·L-I)溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解度很小。在稀氯化钠（0.14mol·L-1）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。 将抽提得到的核蛋白用SDS（十二烷基磺酸钠）处理，DNA(或RNA)即与蛋白质分开，可用氯仿一异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向溶液中加入适量乙醇，DNA即析出。 为了防止DNA（或RNA）酶解，提取时加EDTA（ethy-lenediamine tetraceticacid，乙二胺四乙酸）。 [抽提] 猪脾脏 [预处理] 冷冻，绞碎 组织浆液 [预处理] 0.1M NaCl-0.5M 柠檬酸混合液， 离心 沉淀 1.71M NaCl 上清液 （DNP） 沉淀 （DNP） 溶解液 0.14M NaCl 沉淀物 白色纤维状 DNA 10% NaCl 上清液 （DNA） 氯仿-异戊醇 95%乙醇 真空干燥 工艺路线 具体操作方法 1.取猪肝20~30g，用适量0.14mol·L-1NaCl-0.10mol·L-1EDTA溶液洗去血液，剪碎，加入30~50ml0.14mol·L-1NaCl-0.10mol·L-1EDTA溶液，置匀浆器或研钵中研磨，研磨一定要充分，待研成糊状后，用单层纱布滤去残渣，将滤液离心10分钟（4000r·min-1）弃去上清液，沉淀用0.14mol·L-1NaCl-0.10mol·L-1EDTA溶液洗2~3次。所得沉淀为脱氧核糖核蛋白粗制品。 2.向上述沉淀物加入0.14mol·L-1NaCl-0.10mol·L-1EDTA 溶液，使总体积为37ml，然后滴加25%SDS溶液3ml，边加边搅拌。加毕，至60℃水浴保温10分钟（不停搅拌）溶液变得粘稠并略透明，取出冷至室温。此步操作系使核酸与蛋白质分离。 3.加入5mol·L-1NaCl溶液10ml。是NaCl最终浓度达到1mol·L-1，搅拌10分钟，加入月一辈体积的氯仿-异戊（丙）醇混合液，振摇10分钟，静置分层，取上、中两层液离心10分钟（4000r·min-1）。去掉沉淀，上层清液徐徐加入1.5~2倍95%乙醇，DNA沉淀即析出，用玻璃棒顺着一个方向慢慢搅动，则DNA丝状物即缠在玻棒上。 4.将DNA粗品置于27ml0.015mol·L-1NaCl-0.0015mol·L-1柠檬酸三钠溶液中，再加入3ml1.5mol·L-1NaCl-0.15mol·L-1柠