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蛋白质组学研究技术平台及体液蛋白质组学研究策略 湖南省计划生育研究所 蔡建光 Proteomics Proteome：1994年由澳大利亚科学家Wilkins首先提出概念，1995年7月在Electrophoresis杂志发表。 是指一个基因、一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分。 研究对象：是对不同时间或者空间发挥特定功能的特定蛋白质群体的研究，从蛋白质水平上探索蛋白质作用模式、功能机理、调节控制及蛋白质群体内相互作用，为临床诊断、病理研究、药物筛选、新药开发、代谢途径研究等提供理论依据和基础。 蛋白质组学研究主要技术 分离技术主要有2D、亲和层析、毛细管等电聚焦、毛细管区带电泳和反相高效液相色谱等。 鉴定技术包括质谱分析（MS）、Edman法进行氨基酸组分分析、HPLC等。 蛋白质相互作用技术主要有：酵母双杂交(Y2Z)、亲和层析、免疫共沉淀、蛋白质交联等。 经典技术路线 细胞或组织样品——样品制备——二维凝胶电泳（2D－PAGE）分离蛋白质——计算机辅助分析2D－PAGE图象——对感兴趣的蛋白质进行酶解——质谱分析——数据库检索——蛋白质鉴定——分析蛋白质在细胞与组织中的表达情况。  蛋白质组学研究技术路线 常用技术手段 样品制备 2-DE 蛋白质点的染色 凝胶图像分析 蛋白质鉴定 氨基酸组成分析、蛋白或多肽N端或C端序列分析、MS技术 蛋白质芯片技术 蛋白质数据库 样品制备（1） 是蛋白质组学研究的关键步骤，直接影响到研究结果。 一般过程：细胞或组织样品破碎、溶解、变性、氧化、还原、提取蛋白质组粉、去除非蛋白组分等。 样品制备（2） 通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析, 也可以进行样品预分级, 即采用各种方法将细胞或组织中的全体蛋白质分成几部分,分别进行蛋白质组研究。 激光捕获微切割技术(laser capture microdissection , LCM) 对临床组织样品进行研究, 寻找疾病标记时要解决细胞异质性问题。 采用激光捕获微切割技术（LCM） 较好的解决了组织细胞异质性问题。LCM 是一种快速可靠的组织细胞分离方法, 它可在显微镜监视下, 将单一的细胞群甚至单一细胞从复杂的含有多种细胞的组织切片上分离出来 。 肿瘤的蛋白质组学研究常用LCM技术来获取单一的肿瘤细胞. 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳2-DE基本原理 优点： 大规模混合蛋白的分离和鉴定；适用于修饰蛋白质的发现鉴别；相对比较经济； 局限性：如重复性差；对低拷贝蛋白、部分不溶于样品缓冲液的膜蛋白、高分子量蛋白( 200kD) 及极端酸性和极端碱性蛋白的2DE 无有效的检测手段。 蛋白质点的染色 主要有银染法、考马斯亮蓝染色法和荧光染色法。其他染色试剂有：丽春红s、氨基黑、印度墨、S硫脲银、胶体金、咪唑锌等。 银染法灵敏度高，但是对质谱测定有干扰；考染法可用于胶或膜上染色，操作简单，重现性好，质谱测定需脱色。 若对蛋白质点进行定性分析鉴定, 用银染、考染, 若进行蛋白质定量、半定量分析,就需要选择其他染色法。近几年, 随着图像分析系统的发展, 荧光染色技术更多的用于定量蛋白质组研究。 凝胶图像分析 将凝胶上的蛋白质点通过扫描仪、激光光密度仪、磷光或荧光测定以数字化技术。 其次是对不同来源、不同组织、不同细胞所表达的蛋白质图谱进行比较。 常用软件：ImageMaster2-D、PDquest等。 氨基酸组成分析 原理：通过测定蛋白质中氨基酸所占摩尔百分数或各氨基酸的摩尔比率，然后与数据库中已知蛋白质的理论值进行比较，给出匹配分数值大小，分数值越小表示与该蛋白质越接近。 方法：酸水解 由于某些氨基酸容易破坏，必须用已知蛋白质校正；Edman降解 不能测定N端封闭序列。 常用分析软件：AAComp Ident、ASA、FINDER、AAC-PI、PROP-SEARCH。 蛋白质或多肽的N端、C端序列分析 由于蛋白质末端氨基酸序列具有惊人的专一性，43-83%蛋白质可用N端4个氨基酸残基来确定，74-97%蛋白质可用C端4个氨基酸残基确定。因此若测定N、C端5个残基鉴定蛋白质更确定。 N端测定采用Edman法，C端测定采用羧肽酶法、化学降解法等； 依据N端、C端测序结果检索蛋白质，常用软件是TagIdent。 MS技术简介 质谱（ Mass SPectrometry）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（或质量）的大小顺序排列的图谱。 质谱仪是使分子电离化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离，并检测强度后进行物质分析的仪器。 质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组成。 MS技术 在生物样品分析中，根据离子化方式的不同主要有MALDI(martrix assisted lase