细胞工程 第四章 细胞融合.ppt

第四章 细胞融合;第一节 细胞融合技术概论;一、细胞融合的概念和原理;融 合 过 程;2. 细胞融合的原理 1972年，Singer和Nicolson提出了细胞膜的流体镶嵌模型（fluid mosaic model），强调膜的流动性； 膜的流动性受许多环境因素的影响：温度、pH、极性基团、酶、金属离子、离子强度、电场和（或）电脉冲等； 施加生物、化学或物理诱导因素使细胞膜的脂类分子有序排列发生改变； 当诱导因素解除后，细胞膜恢复原有的有序结构，恢复过程中细胞发生融合。;1.在促融剂的作用下，两原生质体或细胞相互靠近呈致密状态。 2. 相互凝聚的细胞，在融合制剂的作用下，细胞膜性质发生变化，细胞膜发生粘连，形成细胞桥，两膜之间形成微孔。 3.胞质渗透----两个粘连细胞的胞质通过细胞桥进行细胞质相互渗透融合。 4.细胞核融合----胞质融合后，继而发生核的融合形成一个新的单核杂种细胞，不能形成单核的融合细胞逐渐死亡。;三、促进细胞融合的方法;1.灭活病毒促融 病毒是研究最早的促融剂。 1958年冈田善雄偶然发现已灭活的仙台病毒（HVJ，一种副粘病毒）可诱发艾氏腹水瘤细胞相互融合形成多核体细胞。后来科学家证实，其他的副粘病毒、天花病毒和疱疹病毒也能诱导细胞融合。 最常用的是经紫外线照射灭活的仙台病毒，消除了病毒的致病能力，使作用对象更广泛、安全。 ;原理 仙台病毒(HVJ)是由两层磷脂组成的外膜包裹着RNA和蛋白质的复合体，毒性小，易被紫外线灭活。 实验证明：仙台病毒HVJ的外膜是诱导细胞融合的活力部位，与其外膜上的磷脂成分有关，即使被超声波打碎的病毒碎片仍具有促进细胞融合的功能，而与其内部RNA活性无关，即可用灭活的HVJ发挥促融作用。;促融的一般过程 ① 两个细胞在病毒的黏结作用下彼此靠近。 ② 通过HVJ与细胞膜的作用，使两个细胞膜相互连接形成细胞桥，胞质相互渗透。 ③ 两个细胞核相互融合，最终形成融合子细胞。 ④ 融合子细胞可进行正常的细胞分裂，成为杂种子细胞。 ;;融合要点 细胞的融合与HVJ数量有密切关系，每一细胞必须有足够数量的病毒颗粒附着在细胞膜上，细胞才能凝聚。 细胞最适的凝聚温度是4℃，细胞融合的最适温度一般是37℃。因此，在HVJ促融过程中，要先在4℃下细胞凝聚，然后恢复在37℃融合。 由于病毒的致病性与寄生性，制备比较困难；体外诱导产生的细胞融合率比较低，重复性不够高，所以近年来已不多用。;2.聚乙二醇促融法 20世纪70年代以来，越来越多地使用化学试剂作为促融剂来促使细胞融合。例如：二甲亚砜(DMSO)、聚乙二醇（PEG）、脂类、硝酸盐类、Ca 2+络合物等。其中，PEG的应用最广泛。 1974年，加拿大国籍华裔科学家高国楠发现：PEG 具有促进细胞融合的作用。由于PEG比病毒更易制备和控制，活性稳定、细胞毒性小、使用方便，而且促细胞融合的能力更强（比仙台病毒融合率高100～300倍），因此，PEG促融法极大促进了细胞融合的研究。; 聚乙二醇（PEG）是一种多聚化合物，分子式为H (OCH2?CH2) nOH，靠醚键联结，其分子末端带有弱电荷。可溶于水，平均分子量200～20000，一般分子量低于1000的为液态，高于1000为固态。 融合效率与PEG相对分子质量和浓度有关，分子量1000～4000、浓度为30％～50％的PEG具有较好的促融合效果。 ;原理 PEG诱导细胞融合的机理尚不十分清楚。 1. 推测PEG带有大量的负电荷，和原生质体表面的负电荷在钙离子的连接下，形成静电键，降低细胞表面的极性，促使之间粘着和结合，在高pH、高钙离子的作用下，钙离子和结合在质膜上的PEG被洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体形成具有共同质膜的融合体。;;融合要点： 在PEG促进细胞融合时，需要加入一定量的CaCl2促进融合；多采用pH 7.4-7.8，使细胞紧密悬浮，若加入5～15％的二甲亚砜效果更好。 在使用PEG促融时，PEG的浓度增大，细胞黏度和毒性也随之增大，因此一般浓度控制在50%以下，使用浓度为0.01～0.1mol/L。 对于不同类型的细胞，要选择合适浓度的PEG促融。;;3.电击促融法 电融合法（electrofusion）是在20世纪80年代出现的细胞融合技术，借助于电场电脉冲的作用加速原生质体的融合。需要昂贵的电融合仪和特定的条件。;原理;;特点 a、电融合法具有融合效率高（达70％-80％，甚至100